周仁峰
（江苏省滨海县滨淮镇畜牧兽医站，江苏 滨海 224500）
猪伪狂犬病病毒感染易引起猪伪狂犬病，属于严重的烈性传染性疾病，流行性比较广，控制不当或不及时，可能导致经济效益严重受损，需加强病毒分离鉴定工作，为后续治疗提供依据。在病毒分离鉴定中，方法较多，如中和试验、酶联免疫吸附等方法，在实际中应结合具体情况，选择合适的检测方法，保证一定的灵敏性及特异性，减少漏检、误检的情况。本文总结猪伪狂犬病病毒的特点、感染症状及病理变化等情况，并对常见的病毒分离鉴定方法展开分析，旨在为实际工作奠定理论基础。
猪伪狂犬病病毒属于一种疱疹病毒，对环境的耐受性较强，在物体表面或者液体中的存活时间可达到1周，即便是pH值为4～9的环境下，也能保持稳定状态[1]。粒子呈现椭圆形或者圆形，耐热性强，但是对紫外线、福尔马林及脂溶性物质比较敏感，将其置于氢氧化钠溶液中（0.5%～1%），则快速失活。此病毒在全世界范围内均有分布，可以感染猪、猫、犬及牛等家畜，对水貂等野生动物也有一定致病性，在实验动物中，豚鼠、家兔及小鼠等均是常见宿主。此病毒主要会引发伪狂犬病，病猪及带毒猪是主要的传染源，未感染的健康猪群与患病或者携带病毒的猪接触，便会引起感染，包括皮肤损伤、消化道及呼吸道等途径，其中以空气传播为主要途径，乳汁、精液及分泌物也可能会造成病毒传播。
如果感染猪伪狂犬病病毒，一般出现呼吸困难、精神萎靡、痉挛、呕吐、体温升高及抽搐等表现，随着病情发展，还可能引起昏迷甚至是死亡等情况，尤其是4周龄内的仔猪或者初生仔猪，非常容易被感染[2]。如果是妊娠期母猪发病，可见便秘、食欲下降等典型症状，同时出现流产、死胎、产木乃伊胎等现象。公猪感染伪狂犬病病毒后，引起睾丸萎缩、肿胀，失去其生育作用，后备母猪引起不孕。对病死猪剖检发现，伪狂犬病病毒感染后，出现明显的病理变化，包括肾脏针尖状出血点，脑膜部分存在明显充血现象，且脑脊髓液比较多，伴有显著的中枢神经系统症状。同时存在一定卡他性胃炎及肠炎，肝脏、脾脏等脏器出现实质性改变，表现为灰白色病死灶，还会发生肺水肿及充血的情况，也具有不同程度的坏死点。
仔猪感染后出现的症状和细菌疾病、猪瘟等混合感染有所类似，蓝耳病等也会出现死胎的情况，非常容易出现误诊，影响后续有效防控措施的实施，甚至可能措施最佳治疗时间，导致病毒大范围传播，给养殖户造成比较严重的损失。需加强实验室检测，如果疑似链球菌感染或者猪瘟等疾病，但是接种相关疫苗或者使用头孢类药物，并未得到良好控制，应及时将病变样本送检，明确具体病原体，再进行相应的疾病防控处理，才能获取理想效果。待病情稳定后，可定期接种相关疫苗，对于初生的仔猪使用滴鼻免疫的方法，提升整体免疫力。
猪伪狂犬病病毒感染是养殖户重点关注的问题，如果发生感染，且未做好有效控制措施，严重威胁猪的生长发育及生殖状况，给养殖户造成比较严重的经济损失[3]。需要重视此疾病的防控力度，尽量规避经济损失，严格遵循疫苗接种流程执行，定期进行清洁、消毒，维护猪舍的卫生，科学处理污水、排泄物，对饲料用具等也应加强消毒处理，以免发生交叉感染。彻底清理老鼠洞或者其他动物巢穴，做好防蚊、防虫工作，包括使用蚊虫药等方法，切断病毒传播途径，以免导致不必要的损失。
3.1 种猪
实践经验发现，猪伪狂犬病病毒感染种猪后，对母猪的胎盘造成损害，直接侵入子宫感染胎儿，引起过早夭折。如果是在妊娠早期，子宫内的胚胎会被吸收，表现为假怀孕，影响母猪返情率[4]。如果是在妊娠中期，便会引起流产、木乃伊胎、死胎等情况，即便是产下活胎，其身体状况较差，通常在一段时间后便会夭折。除以上生殖障碍外，也可能导致种猪永久丧失配种能力，给养殖户带来一定经济损失。
3.2 哺乳仔猪
猪伪狂犬病病毒可以乳汁、尿液等传播，感染性比较强，一般以4周龄内的仔猪为主，其对病毒的抵抗力比较弱，即便出生时没有发生明显异常情况，也可能会在出生后第2天大范围死亡。早期出现不进食、高温、呼吸困难等现象，随着病情发展，表现出神经症状，最终引起死亡。
3.3 断奶仔猪
如果在断奶后感染病毒，仔猪出现腹泻、厌食及高热等表现，由于个体差异的原因，部分还可能发生眼球外翻、呼吸困难、角弓反张及咳嗽等表现，发育情况也不理想。
3.4 生长育肥猪
如果是在正常饲养阶段感染病毒，引起咳嗽、呼吸困难及气喘等情况，对其生命安全造成一定威胁。还会增加猪肺疫、副嗜血杆菌病等发生风险，导致个体生长迟缓，甚至出现停止生长的情况，严重影响饲料回报率，造成养殖成本增加，经济效益降低[5]。
不同的病毒具有的毒力各有差异，如GN9801株，危害性较大，病程长，可以导致死胎、流产，但是发病率比较低。随着生物科学技术的快速发展，猪伪狂犬病检测方法不断更新，包括血清学检测及分子生物学方法等，如中和试验、酶联免疫吸附，能对相应的病毒进行良好区分和鉴别，敏感性均比较高。在实际过程中，猪如果感染伪狂犬病病毒，通常难以彻底清除，需要将被感染的种猪彻底淘汰，彻底终止病毒的传播，否则如果猪群受到应激或者免疫力下降，可能会造成疾病反复，病毒进一步扩散，安全隐患较大。
4.1 病毒分离培养
采集病猪的肺、脑等组织样本，将其进行剪碎、匀浆等处理，根据说明书要求加入适量Hank"s平衡盐溶液，制成组织混悬液，并进行离心处理，取上清液。在无菌环境下，使用微孔滤膜进行过滤，并添加链霉素及青霉素等试剂，最后将混合物置于-40 ℃温度下保存[6]。
选择PK-15细胞作为病毒培养基，取上述病料1 mL接种于生长状态良好的细胞瓶内，并设置阴性对照，在37 ℃环境下培育1 h左右，再添加10 mL细胞维持液，持续培养48 h后再观察生长情况。经过传代培养，直至细胞病变时间稳定，便可以中止该环节，将培养物保存于-40 ℃环境。
4.2 病毒鉴定
（1）中和试验。属于比较经典的检测方法，将连续倍比稀释的血清和病毒株互相混匀，形成1∶1的混合物，静置于37 ℃环境下1 h，选择96孔的培养板培育鸡胚成纤维细胞或者猪肾继代细胞，并接种病毒株混合物，置于5% CO2、37 ℃环境下，对细胞病变进行观察，确定血清中和效价，如果数值不低于1/2，即可认定为阳性。该方法工作量较大，且操作复杂，容易受到细胞、技术等条件的影响，制约实际临床应用情况。
（2）酶联免疫吸附。该方法敏感性、特异性较高，操作简便，能快速进行检测，比较适用于大批量的样品测定，其中，早期检测可以选择IgM-ELISA。随着生物科学技术的不断发展，我国已经逐渐形成比较成熟的疫苗毒株、野毒的鉴别方法和经验[7]。如gE-ELISA、gE-LAT，敏感性比较高，且具有良好的重复性，能有效区分自然感染野毒的阳性猪、疫苗活苗免疫猪，比较适合猪伪狂犬病诊断。此外，双抗体夹心检测也具有良好的特异性和敏感性，在组织PRV检测中应用广泛。
（3）乳胶凝集试验。主要是基于抗原抗体特异性结合的原理，抗原和乳胶结合后，再与血清进行充分反应，如果在规定时间内出现凝集，则提示为阳性，在猪伪狂犬病鉴别诊断中应用较广。目前已出现LAT诊断试剂盒，操作比较方便，且敏感性高，具有简单、快速的特点，比较适合流行病学调查、疫病监测，也可以用于猪群初次筛选。
（4）胶体金免疫层析。基于PCR技术，克隆表位基因并插至目标载体，形成表达质粒后诱导表达，再结合胶体金标记，建立免疫层析试纸，可直接用于疾病临床诊断，操作比较简单，且特异性和灵敏度均较高[8]。试纸可以在室温条件下长期保存，不会对敏感性、特异性造成明显影响，该方法可用作野毒感染快速筛查。
（5）分子生物学方法。核酸探针属于常见的分子生物学方法，杂交法等手段，标记基因组DNA，并将重组质量作为探针，对病毒进行鉴定、检测，特异性较高。与此同时，也可以使用基因芯片的方法，获取PRVgB等靶基因，制备相应的检测基因芯片，灵敏度高，芯片质量较好且可重复利用，也具有良好的重复性，能实现猪细小病毒、伪狂犬病病毒等同时检测的目的，对基因缺失疫苗毒及野毒进行区分，诊断应用前景好。
（6）PCR方法。包括多重PCR、实时定量PCR、环介导等温扩增等方法，其中，多重PCR技术比较常用，操作简单易行，具有敏感性高、快速的特点。目前猪伪狂犬病及其他病毒病均可以采用该方法检测，特异性好，能有效区分不同疾病，对于混合感染的检测也具有积极意义，能在一定程度上节省人力和检测时间，可以用作常用的流行病学调查手段。实时定量PCR能实现定量检测，具有快速、敏感等特点，可用于大量样品的检测，主要是基于病毒基因序列，优化PCR反应条件，建立实时检测方法。环介导等温扩增比较适合现场检测，属于新兴技术，反应速度及引物设计等均有明显优势，性能优异，适用范围比较广。相比普通的PCR检测技术，其特异性更好，灵敏度高，能在早期对自然感染野毒、基因缺失疫苗进行快速区分。
猪是伪狂犬病毒常见的传播者、宿主，易引起急性传染，导致呼吸困难、体温升高及其他神经症状，影响其正常生长发育，如果是种猪感染，还会导致死胎、流产等，对公猪的生育价值造成损害，且死亡率较高，给养殖户造成比较严重的经济损失。该疾病呈现散发特征，如果未及时进行合理控制，可能会导致大范围传播，通常仔猪更容易发病，加强病毒分离鉴定，能及时明确病原，便于采取针对性的干预措施。如中和试验、酶联免疫吸附反应等方法，效果比较理想，可获得较高的敏感度和特异性。有效病毒分离鉴定，能快速明确致病源，根据病毒特点，在日常清洁和消毒的同时，开展相应的病毒预防措施，有效降低养殖场的损失，为我国养殖业的健康发展提供支持。
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