符艳 赵四林 王伟 肖雪飞
哮喘是一种以气道反应过度、支气管炎症和气道重塑为特征的炎症综合症，严重危害人类的生命健康。气道平滑肌细胞(ASMC)增殖，是导致气道结构改变的病理学基础，在气道重塑的发生发展中起重要作用[1]。血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子等生长因子，是促进ASMC增殖的主要炎症介质[2]，抑制或减少这些生长因子诱导的ASMC增殖，对控制气道重塑的发生及哮喘治疗尤为重要，也是当前哮喘研究的热点。布地奈德(budesonide，Bud)是一种糖皮质激素，具有显著局部抗炎作用，其可抑制人体抗原合成，减少炎性因子生成[3]。研究显示，布地奈德可改善支气管哮喘患者肺功能，缩短临床症状转归时间，提高哮喘患者治疗疗效[4]。但目前，布地奈德治疗哮喘的分子机制尚未明确。微小RNA(miRNA)是一类参与调控细胞增殖、凋亡、炎症反应及氧化应激等生理或病理过程的小分子非编码RNA，在哮喘等炎症性疾病的发生发展中起重要调控作用[5-6]。有报道称，下调miR-620可抑制转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的气道平滑肌细胞增殖[7]，提示miR-620可能是改善气道重塑、治疗哮喘的分子靶点。因此，本研究以小鼠ASMC为研究对象，旨在观察布地奈德对血小板衍生生长因子(PDGF)诱导的小鼠ASMC增殖和炎性因子表达的影响及其能否调控miR-620发挥作用。
一、 细胞和试剂
小鼠ASMC，上海泽叶生物科技有限公司；
布地奈德(Bud)，辽宁玉皇药业有限公司；
PDGF，武汉优尔生公司；
RPMI 1640培养基、细胞计数试剂盒-8(CCK-8)和二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒，北京索莱宝公司；
胎牛血清(FBS)，浙江天杭生物科技公司；
LipofectamineTM 2000试剂盒和Trizol试剂，美国Invitrogen公司；
miR-620模拟物(mimics)、模拟对照序列(miR-mimics-NC)、miR-620抑制剂(inhibitor)、抑制剂阴性对照序列(miR-inhibitor-NC)和PCR引物，上海生工生物工程有限公司；
IL-4、IL-5和IL-13试剂盒，南京建成生物工程研究所；
兔抗细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、P21和β-肌动蛋白(β-actin)，美国Santa Cruz公司；
逆转录试剂盒和PCR试剂盒，大连宝生物工程有限公司。
二、 方法
1 细胞培养和转染 复苏ASMC，用含10 % FBS的RPMI 1640培养基(常规培养基)培养。将对数生长期的ASMC以5.0×105个/孔接种于6孔板中，采用LipofectamineTM 2000脂质体法，分别转染miR-620 inhibitor、miR-inhibitor-NC、miR-620 mimics、miR-mimics-NC。转染6 h后，更换培养基。再培养24 h，收集细胞备用。
2 细胞分组处理 未转染的ASMC分为Control组、PDGF组、PDGF+Bud-200组、PDGF+Bud-400组、PDGF+Bud-600组，Control组细胞用常规培养基培养，PDGF组细胞用含20 ng/mL[1]PDGF的培养基培养，PDGF+Bud-200组、PDGF+Bud-400组、PDGF+Bud-600组细胞分别用含200、400、600 μg/mL Bud与20 ng/mL PDGF的培养基共同培养。转染miR-620 inhibitor、miR-inhibitor-NC的细胞用常规培养基培养，记为PDGF+miR-620 inhibitor组、PDGF+miR-inhibitor-NC组。转染miR-620 mimics、miR-mimics-NC的细胞用含600 μg/mL Bud与20 ng/mL PDGF的培养基共同培养，记为PDGF+Bud-600+miR-620 mimics组、PDGF+Bud-600+miR-mimics-NC组。
3 CCK-8法检测细胞增殖 将未转染的ASMC、转染miR-620 inhibitor、miR-inhibitor-NC、miR-620 mimics、miR-mimics-NC的ASMC均以1.0×104个/孔接种于96孔板中，按照1.2.2分组处理，培养24 h后，加10 μL CCK-8试剂。孵育2 h后，酶标仪450 nm检测各孔光密度(OD)值。
4 Western Blot法检测细胞中CyclinD1、P21蛋白表达 将未转染的ASMC、转染miR-620 inhibitor、miR-inhibitor-NC、miR-620 mimics、miR-mimics-NC的ASMC均以5.0×104个/孔接种于6孔板中，按照1.2.2分组处理，培养24 h后，RIPA试剂提取细胞中总蛋白。BCA法检测蛋白含量后，以20 μg/孔蛋白行SDS-PAGE电泳。电泳后，将分离蛋白转至PVDF膜，并于5 %脱脂奶粉溶液中封闭1 h。然后分别于CyclinD1、(1 ∶500)、P21(1 ∶500)和β-actin(1 ∶1000)一抗孵育液中4℃过夜。再于山羊抗兔二抗(1 ∶3000)孵育液中37℃孵育1 h。最后加显影液避光显影，曝光拍照。
5 试剂盒法检测细胞中IL-4、IL-5和IL-13表达 将未转染的ASMC、转染miR-620 inhibitor、miR-inhibitor-NC、miR-620 mimics、miR-mimics-NC的ASMC均以5.0×104个/孔接种于6孔板中，按照1.2.2分组处理，培养24 h后，收集各组细胞培养上清液，3500 r/min离心5 min，保留上清。分别参照IL-4、IL-5和IL-13试剂盒说明书，检测上清中其含量。
6 RT-qPCR检测细胞中miR-620表达 细胞接种及处理情况同1.2.4。Trizol试剂提取各组细胞中总RNA，逆转录为cDNA后，行PCR扩增。引物序列：miR-620上游5′-GCCGAGATGGAGATAGATAT-3′，下游5′-CTCAACTGGTGTCGTGG-3′；
内参U6上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。2-△△Ct法计算miR-620相对于内参U6的表达水平。
三、 统计学分析
一、 布地奈德对PDGF诱导的小鼠气道平滑肌细胞增殖的影响
与Control组比较，PDGF组细胞OD值升高(P<0.05)，细胞中CyclinD1蛋白表达升高(P<0.05)，而P21蛋白表达降低(P<0.05)。与PDGF组比较，PDGF+Bud-200组、PDGF+Bud-400组、PDGF+Bud-600组细胞OD值降低(P<0.05)，细胞中CyclinD1蛋白表达降低(P<0.05)，而P21蛋白表达升高(P<0.05)(见表1，图1)。
表1 布地奈德对PDGF诱导的小鼠气道平滑肌细胞增殖的影响
图1 布地奈德对PDGF诱导的气道平滑肌细胞CyclinD1和P21蛋白表达的影响
二、 布地奈德对PDGF诱导的小鼠气道平滑肌细胞炎症因子的影响
与Control组比较，PDGF组IL-4、IL-5和IL-13水平升高(P<0.05)。与PDGF组比较，PDGF+Bud-200组、PDGF+Bud-400组、PDGF+Bud-600组IL-4、IL-5和IL-13水平降低(P<0.05)(见表2)。
表2 布地奈德对PDGF诱导的小鼠气道平滑肌细胞炎症因子的影响
三、 布地奈德对PDGF诱导的小鼠气道平滑肌细胞中miR-620表达的影响
与Control组比较，PDGF组miR-620水平升高(P<0.05)。与PDGF组比较，PDGF+Bud-200组、PDGF+Bud-400组、PDGF+Bud-600组miR-620水平降低(P<0.05)(见表3)。
表3 布地奈德对PDGF诱导的小鼠气道平滑肌细胞中miR-620的影响
四、 沉默miR-620对布地奈德对PDGF诱导的小鼠气道平滑肌细胞增殖和炎症因子的影响
与PDGF+miR-inhibitor-NC组比较，PDGF+miR-620 inhibitor组miR-620水平降低(P<0.05)，细胞OD值降低(P<0.05)，CyclinD1蛋白水平降低(P<0.05)，而P21蛋白水平升高(P<0.05)，IL-4、IL-5和IL-13水平降低(P<0.05)(见表4，图2)。
图2 沉默miR-620对PDGF诱导的气道平滑肌细胞CyclinD1和P21蛋白表达的影响
五、 过表达miR-620逆转布地奈德对PDGF诱导的小鼠气道平滑肌细胞增殖和炎症因子的影响
与PDGF+Bud-600+miR-mimics-NC组比较，PDGF+Bud-600+miR-620 mimics组miR-620水平升高(P<0.05)，细胞OD值升高(P<0.05)，CyclinD1蛋白水平升高(P<0.05)，而P21蛋白水平降低(P<0.05)，IL-4、IL-5和IL-13水平升高(P<0.05)(见表5，图3)。
图3 过表达miR-620逆转布地奈德对PDGF诱导的气道平滑肌细胞CyclinD1和P21蛋白表达的影响
气道重塑是指哮喘时气道壁结构发生一系列改变，包括气道壁增厚、气道纤维化、平滑肌细胞增生和肥大等，与哮喘患者预后密切相关[8]。气道平滑肌细胞是气道壁结构的主要组成细胞，也是参与气道重塑的关键效应细胞，其过度增殖除了加重气道高反应性之外，还可导致气道壁变性，引起不可逆的气道损伤[9]。因此，抑制气道平滑肌细胞增殖对防治哮喘具有积极意义。PDGF是重要的促有丝分裂原，可促进气道平滑肌细胞增殖，引起气道平滑肌细胞表型改变，促进气道重塑的发生[10]。本研究显示，PDGF促进了小鼠气道平滑肌细胞的增殖及炎性因子IL-4、IL-5和IL-13的表达，与相关报道结果一致[11]。
布地奈德具有治疗哮喘的功效。研究显示，布地奈德可协同骨化三醇抑制哮喘小鼠气道重塑[12]；
细辛脑联合布地奈德可显著减少炎症因子骨桥蛋白和血管内皮生长因子的产生，减弱哮喘小鼠气道炎症损伤和气道重塑程度[13]。本研究将一定剂量的布地奈德作用于PDGF诱导的小鼠气道平滑肌细胞，结果显示，细胞增殖能力降低，说明布地奈德抑制了PDGF诱导的小鼠气道平滑肌细胞增殖。细胞增殖受多种基因分子的调控，其中CyclinD1是细胞周期调控分子，其可激活细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4，诱导细胞周期由G1期进入S期，加速细胞增殖[14]，而P21则减弱细胞周期蛋白依赖性激酶的活性，抑制细胞的增殖能力[15]。本研究显示，一定剂量的布地奈德可降低PDGF诱导的小鼠气道平滑肌细胞中CyclinD1蛋白表达，而促进P21蛋白表达，进一步说明布地奈德抑制了PDGF诱导的小鼠气道平滑肌细胞增殖，其作用可治疗哮喘气道重塑。IL-4、IL-5和IL-13是重要的炎性介质，在支气管哮喘的发病中起重要作用。本研究显示，布地奈德可抑制PDGF诱导的小鼠气道平滑肌细胞表达IL-4、IL-5和IL-13炎性因子，提示布地奈德可降低哮喘气道炎症反应。
研究已表明，多种miRNA参与调控哮喘气道平滑肌细胞增殖和炎症反应，可作为哮喘气道重塑的分子治疗靶点。miR-326可通过抑制TNFSF14降低TGF-β1诱导的ASMC的基质蛋白沉积和细胞增殖[16]；
上调miR-204-5p通过负调节Six1抑制TGF-β1诱导的气道平滑肌细胞增殖和细胞外基质生成，是哮喘气道重塑的潜在治疗靶点[17]。本研究显示，沉默miR-620抑制了PDGF诱导的小鼠气道平滑肌细胞增殖及炎性因子IL-4、IL-5和IL-13的表达，与Chen等[7]报道的下调miR-620抑制了转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的气道平滑肌细胞增殖的结果一致，提示miR-620是可能用作哮喘气道重塑的分子靶点。本研究还显示，布地奈德可抑制PDGF诱导的小鼠气道平滑肌细胞表达miR-620，而过表达miR-620逆转了布地奈德对PDGF诱导的小鼠气道平滑肌细胞增殖及IL-4、IL-5和IL-13的表达，提示布地奈德可能通过下调miR-620来抑制PDGF诱导的小鼠气道平滑肌细胞增殖及炎性因子表达。
综上，布地奈德可抑制PDGF诱导的小鼠气道平滑肌细胞增殖及炎性细胞因子表达，其作用机制可能与下调miR-620表达有关。
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