王国英,王瑞生,朱树国,王 勤,莫日根,周 刚*,朱叶青*
(1.内蒙古自治区药品检验研究院,内蒙古 呼和浩特 010020; 2.呼和浩特市检验检测中心,内蒙古 呼和浩特 010020; 3.呼和浩特市农牧技术推广中心,内蒙古 呼和浩特 010020)
酪蛋白胨是以酪蛋白(从牛奶中提取,又称干酪素、酪朊、乳酪素)作为原材料,经胰蛋白酶消化水解、中和、过滤、浓缩精制而成的粉末。酪蛋白胨与一般蛋白胨相比水解程度更高、胨分子量分布更加均衡,国际上普遍将酪蛋白胨用作培养基的氮源[1]。然而国内外普遍存在培养基质量差异和批间质量不稳定的问题[2-4],酪蛋白胨作为培养基的主要原材料,其质量已经成为培养基生产企业提升产品质量的瓶颈[5]。在我国培养基质量标准体系建设较为落后[6],对培养基原料的系统研究较少[7],对酪蛋白胨的检测指标主要有pH值、澄明度、含水量、炽灼残渣、含氮量等[8]。为了提升我国培养基的总体质量,缩小与国际知名品牌培养基的差距,我们通过对酪蛋白胨中氨基酸进行定量,来有效的控制培养基原材料的质量。
目前,氨基酸的测定方法很多,有气相色谱法[9]、液相色谱法[10]、离子色谱法[11]、气相色谱-串联质谱法[12]、液相色谱-串联质谱法[13]、同位素质谱法[14]等。氨基酸自动分析仪法是最常用的一种分析方法[15-17],它是以阳离子交换树脂为固定相,酸性缓冲液为流动相,在柱后采用茚三酮溶液与氨基酸衍生生成具有可见光吸收的衍生物进行检测,具有重复性好、仪器稳定、结果可靠等优点[18]。本文通过对酪蛋白胨的水解条件参数进行优化,建立了氨基酸分析仪测定酪蛋白胨中17种氨基酸的方法,该方法准确、灵敏,填补了我国培养基原材料酪蛋白胨中氨基酸数据的空白,为研制纯化学培养基以及提升我国培养基质控水平提供数据支撑。
1.1 仪器与试剂
氨基酸分析仪:S-433D型,德国sykam公司;微波消解仪:ETHOS UP型,德国Milestone公司;万分之一电子天平:ME204E型,瑞士Mettler Toledo公司;氮吹仪:N-EVAP-45型,美国Organomation公司;超纯水机:Milli-Q型,美国Milliproe公司。
17种氨基酸混合标准品,和光纯药工业株式会社,日本;甲醇,色谱纯,德国CNW公司;乙醇,色谱纯,美国MREDA公司;柠檬酸三钠(二水),优级纯,北京化工厂;盐酸,优级纯,国药集团化学试剂有限公司;辛酸,优级纯,天津市光复科技发展有限公司;氢氧化钠,分析纯,科茂化学试剂有限公司;柠檬酸,分析纯,天津盛奥化学试剂有限公司;硼酸,分析纯,天津市大茂化学试剂厂;苯酚,分析纯,天津市风船化学试剂科技有限公司;EDTA,分析纯,天津光复试剂有限公司;茚三酮,分析纯,国药集团化学试剂有限公司。
5批酪蛋白胨:锡林浩特市鼎安生物科技有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 溶液配制
缓冲A1:柠檬酸三钠(二水)11.8 g,柠檬酸6.0 g,乙醇70mL,HCl(浓)5.6 mL,辛酸0.1 mL,纯水定容至1000 mL,氢氧化钠或盐酸调节pH值至3.45,0.45 μm 的有机系滤膜过滤。
缓冲B1:柠檬酸三钠(二水)19.6 g,硼酸5.0 g,氢氧化钠 3.1 g,辛酸0.1 mL,纯水定容至1000 mL,氢氧化钠或盐酸调节pH值至10.85,0.45 μm 的有机系滤膜过滤。
再生液C1:氢氧化钠 20.0 g,EDTA 0.2 g,纯水定容至1000 mL,0.45 μm 的有机系滤膜过滤。
衍生试剂D1:20 g 茚三酮晶体,2 g苯酚,600 mL甲醇;缓慢搅拌到所有的茚三酮晶体完全溶解,0.45 μm 的有机系滤膜过滤,加入400 mL过滤后钾钠缓冲液(PH5.51),转移到茚三酮试剂瓶中,氮气从底部吹大约3至5分钟,加入VC后氮气再从底部吹大约3至5分钟。
样品稀释液:柠檬酸三钠(二水)11.8 g,柠檬酸6.0 g,HCI(浓)10.4 mL,辛酸0.1 mL,纯水定容至1000 mL,氢氧化钠或盐酸调节pH值到2.20,0.45 μm 的有机系滤膜过滤。
精确吸取17种氨基酸混合标准液,用超纯水稀释成37.5 μmol/L的混合标准中间液。根据需要再用超纯水配成适当浓度的系列混合标准工作溶液,临用现配。
1.2.2 样品前处理
精密称取混合混匀的样品0.2 g(精确至0.0001 g)于消解管中,加入6 mol/L的盐酸5 mL,密闭。水解功率1000 W,温度150 ℃,消解40 min,冷却后,转移至50 mL 容量瓶中,用水定容至刻度,摇匀,移取 1.00 mL氮气吹干,用5.00 mL稀释液复溶,并用稀释液定容至50 mL 容量瓶中,摇匀、过膜,注入氨基酸分析仪测定。
1.2.3 仪器工作参数
色谱柱:LCA K06/Na(4.6 mm×150 mm);衍生泵流速:0.25mL/min;柱温:58 ℃; 高温反应器温度:130℃;检测波长:440nm(脯氨酸)、570 nm;进样量20 μL,洗脱方式:梯度洗脱,见表1。
图1 17种氨基酸混合标准溶液谱图
表1 氨基酸分析仪泵参数
2.1 微波水解条件的优化
微波水解温度的优化:在微波功率1000 W、水解时间40 min固定不变的情况下,分别考察水解温度130 ℃、140 ℃、150 ℃、160 ℃、170 ℃、180 ℃对酪蛋白胨中各种氨基酸含量的影响,结果发现,随着测试温度从130 ℃升高到180 ℃,氨基酸的总检出量出现了先升高后下降的趋势,在150 ℃的时候,酪蛋白胨中总氨基酸的含量达到最大值,为845.37 g/kg,随着温度的继续升高,胱氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、酪氨酸均有不同程度的下降,其他氨基酸逐渐趋于平稳,因此,我们最终选择150℃作为水解温度。
微波水解时间的优化:在微波功率1000 W、水解温度150 ℃条件下,水解时间在10～40 min时,酪蛋白胨中氨基酸的总含量迅速升高,40 min时总氨基酸的含量高于其他各时间点,40～50 min时趋于稳定,没有明显增高,所以我们选择40 min为最佳水解时间。
2.2 线性范围、检出限、定量限和精密度
按照优化的方法进行测定,采用外标法定量,以氨基酸的质量浓度为横坐标(x, μg/mL)、相应的色谱峰面积为纵坐标(y)进行线性回归分析,得到17种氨基酸的标准曲线,见表2。结果表明各目标物在相应的浓度范围内线性关系良好,相关系数(r)均大于0.998。分别以信噪比(S/N)的3倍和10倍进样浓度确定该法的最低检出限和定量限分别为:0.02～1.22 g/kg、0.07～4.05 g/kg。
表2 17种氨基酸的标准曲线方程、相关系数、线性范围、检出限及定量限
同一混合均匀的酪蛋白胨样品取6份,按照优化好的方法进行测定,氨基酸均有检出,计算17种氨基酸的相对标准偏差,RSD的范围为均≤4.5%,表明该方法的精密度良好。
2.3 方法的准确度与精密度
精密称取上述蛋白胨样品6份,分别添加定量的氨基酸混合标准溶液,在上述优化的条件下进行水解,测定氨基酸的含量,计算回收率,结果见表3,17种氨基酸的平均回收率为80.6%～106.5%,相对标准偏差RSD(n=6)≤4.9%。
表3 17种氨基酸的加标回收率(n=6)
2.4 样品的测定
按照上述建立的17种氨基酸含量的测定方法对5个批次酪蛋白胨进行测定,氨基酸测定结果见表4,由测定结果可知酪蛋白胨中17种氨基酸均有检出,其中含量最高的为谷氨酸,在172.36～182.93 g/kg之间,胱氨酸含量最低在1.17～2.86 g/kg之间,其他氨基酸含量在13.56～92.64 g/kg之间。氨基酸的含量约占到酪蛋白胨的77%以上。
表4 酪蛋白胨中17种氨基酸的含量(g/kg)
本实验以酪蛋白胨为研究对象,通过对样品水解条件的参数进行优化,建立了经过微波水解后使用氨基酸分析仪测定样品中17种氨基酸含量的方法,该方法前处理所用时间短、所得数据准确可靠,适用于酪蛋白胨中氨基酸含量的测定,对于进一步研究本品的蛋白质和多肽组成具有重要的意义,为提升我国培养基评价规范提供了基础的保障。
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