赵宁，郭喜良
(锦州医科大学，辽宁 锦州 121000)
随着全球经济的发展，糖尿病已成为威胁人类健康的重要疾病之一。据估计，到2040年全世界可能有6亿糖尿病患者[1]。糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病常见的眼部并发症之一，在糖尿病患者中总发病率为35%，是导致成人失明的主要原因[2]。然而，目前临床上针对糖尿病视网膜病变仍然缺乏有效的药物和治疗方法。近年来的研究表明，视网膜神经组织病变在DR的早期阶段越来越受到关注[3]，主要的病理改变包括星形胶质细胞活化、视网膜Müller细胞凋亡、神经节丧失、核层变薄等[4-5]。Müller细胞是视网膜胶质细胞的主要组成部分，在维持视网膜功能结构中发挥着必不可少的作用。此外，Müller细胞能分泌多种细胞因子，为视网膜神经元提供营养支持，在维持视网膜生理功能方面发挥重要作用[6]。
在DR发生和发展过程中，炎症反应越来越受到重视。在DR形成过程中，多种炎症因子可诱导环氧化酶2(COX2)的表达。已有研究报道，由COX2/前列腺素E2(PGE2)信号通路介导的炎症反应，激活NF-κB，释放大量的炎症因子，导致视网膜毛细血管细胞凋亡、视网膜周细胞和毛细血管退行性变，促进DR的发生发展[7-8]。红景天苷是中药红景天中分离出来的一种活性成分，具有多种生物活性和药理活性。有研究表明，红景天苷能有效降低血糖浓度，起到抗氧化应激、抗炎症、抗凋亡等药理作用[9-11]。本研究旨在探讨Sal对高糖作用后rMC-1细胞凋亡的抑制作用。
1.1 材料
rMC-1为本实验室保存；
胎牛血清购自杭州四季青有限公司；
DMEM培养基购自Hyclone生物科技有限公司；
Sal购自美伦生物技术有限公司(纯度≥98%)；
PGE2ELISA试剂盒购自北京索莱宝公司；
COX2多克隆抗体购自英国Abcam公司；
Bax、Bcl-2多克隆抗体购自万类生物科技有限公司；
SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒、Annexin-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自索莱宝科技有限公司；
CCK8试剂盒购自上海尚宝生物科技有限公司；
NS398购自英国Sigma公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
用含体积分数10% FBS的完全高糖DMEM培养基培养rMC-1，将其置于37 ℃、50 mL/L CO2培养箱中。当细胞融合率至70%时，传代培养。
1.2.2 CCK8法检测细胞活力
取对数生长期的rMC-1，将细胞密度调整至1×104个/孔接种在96孔板中，待细胞贴壁后，按照0、0.125、0.25、0.5、1 mmol/L浓度将Sal分别置于高糖培养基中培养48 h。在待测孔中加入CCK8试剂，培养箱中孵育1.5 h，用酶标仪在490 nm波长处测定。
1.2.3 细胞分组
实验分为4组，即正常对照组：DMEM培养液(葡萄糖浓度为5.5 mmol/L)；
高糖组：高糖DMEM培养液(葡萄糖浓度为35.5 mmol/L)；
Sal干预组：高糖DMEM培养液+Sal 0.5 mmol/L；
COX2抑制剂组：在高糖培养基中加入NS398(浓度为10 μmol/L)，均培养48 h。
1.2.4 ELISA法检测PGE2水平
将rMC-1按照5×105个/孔密度接种于6孔板中，置于细胞培养箱中培养24 h，贴壁后换液。各组细胞按照1.2.3处理方法培养以后，收集细胞培养上清液，置于4 ℃下，以1000 rpm转速离心10 min，收集培养液上清液。分别加入50 μL标准品和样品于相应孔中，按照ELISA试剂盒说明书操作步骤进行实验。酶标仪测定450 nm处吸光度OD值。实验重复3次，每次各组设置3个复孔。
1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡
各组细胞按照1.2.3处理方法培养以后，加入预冷的PBS洗涤，离心沉淀细胞后用1 mL 1×BindingBuffer重新悬浮细胞，调整细胞浓度为1×108/L。每管加入100 μL细胞悬液，再加入AnnexinV-FITC(5 μL)于5 mL流式管中，轻轻混匀后，室温下避光孵育10 min。加入5 μL碘化丙啶溶液(PI)，室温下避光孵育5 min。加入PBS至500 μL，在1 h内用进行流式细胞检测。
1.2.6 Western blot检测蛋白相对表达
各组细胞按照1.2.3处理方法培养以后，提取细胞总蛋白，10%SDS-PAGE电泳、转至PVDF膜、室温封闭漂洗后，分别孵育抗COX2、Bcl-2、Bax、抗内参照GAPDH的一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次后，加入HRP标记的二抗室温孵育90 min。TBST洗涤3次后，使用ECL试剂盒显影。
1.3 统计学方法
应用SPSS 19.0软件处理实验结果，计量资料结果以均数±标准差表示，在方差齐性条件下采用单因素方差(one-way ANOVA)分析。两组组间比较采用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 CCK8检测rMC-1细胞活力
通过CCK8检测Sal对高糖作用后rMC-1细胞活力的影响，见表1。高糖作用后rMC-1增殖率明显降低(P<0.05)；
与高糖组比较，Sal干预组(0.125 mmol/L，0.25 mmol/L)细胞增值率无统计学差异，Sal干预组(0.5 mmol/L，1 mmol/L)细胞增殖率显著上升(P<0.05)。Sal在浓度为0.5 mmol/L及1 mmol/L时细胞增值率相差不大，无统计学差异，因此实验筛选Sal最佳浓度为0.5 mmol/L用于后续细胞实验。
表1 各组细胞增值率变化
2.2 Elisa法检测PGE2水平
Elisa检测SAL对高糖作用后rMC-1细胞炎性细胞因子PGE2的影响。高糖作用后PGE2表达水平显著升高(P<0.01)。与高糖组相比，0.5 mM Sal干预高糖作用的rMC-1细胞48 h后，细胞培养上清液中PGE2表达量明显降低(P<0.05)。COX2/PGE2信号通路在炎症反应过程中发挥重要作用，为了研究该通路是否参与了高糖诱导的rMC-1损伤，使用COX2抑制剂NS398。与高糖组比较，COX2抑制剂组PGE2表达量显著降低(P<0.05)，见表2。
表2 PGE2、COX2的表达变化
2.3流式细胞术检测细胞凋亡
流式细胞仪检测各组细胞凋亡，与对照组相比，高糖作用后细胞凋亡率著增加(P<0.01)。与高糖组相比，0.5 mM Sal干预高糖作用的rMC-1细胞48 h后，凋亡率显著降低，COX2抑制剂组细胞凋亡率降低(P<0.05)，见图1、表3。
图1 Sal对细胞凋亡率的影响
表3 Sal对细胞凋亡率及Bax、Bcl-2表达水平的影响
2.4 Western blot检测COX2、Bax、Bcl-2蛋白质的表达量
Western blot检测凋亡相关蛋白的表达情况。与正常对照组比较，高糖组rMC-1细胞中COX2、Bax表达量明显升高，Bcl-2表达量明显降低(P<0.01)。与高糖组比较，Sal干预组、COX2抑制剂组COX2、Bax表达量显著降低，Bcl-2表达量明显升高(P<0.05)，见图2、表3。
A：正常对照组；
B：高糖组；
C：Sal干预组；
D：COX2抑制剂组
DR是糖尿病患者最常见、最严重的眼部微血管并发症之一。其发病率及严重程度随着糖尿病病程的延长而增加。糖尿病病程在5年之内，DR的发病率为44.4%。当糖尿病的病程延长至7年，DR的发病率可达到56%以上[12]。高血糖状态是DR发生发展的基础，视网膜神经元、神经胶质细胞在长期高血糖的环境下代谢紊乱，继而引发微血管损伤。DR的发生与血糖升高密切相关[13-14]，长期高血糖可导致视网膜Müller细胞细胞器损伤，细胞超微结构改变，进而导致Müller细胞活化，引起其功能障碍。有研究报道，体外高糖环境诱导视网膜Müller细胞发生炎症反应，进而降低细胞活力[15]。本研究采用CCK8检测Sal对高糖作用rMC-1细胞活力的影响，结果表明，Sal能够显著提高高糖作用后Müller细胞活力。
DR的发病机制十分复杂，炎症反应是其关键因素之一。炎症反应通过破坏血-视网膜屏障，导致DR患者视网膜结构及功能发生异常改变[16]。COX2是一种广泛存在的炎症介质，在正常情况下，几乎检测不到其表达，但在病理情况下表达水平上调，并通过催化花生四希酸合成大量PGE2[17]。PGE2是COX2的主要下游代谢产物，在DR动物模型中，高糖作用使COX2表达水平上调，随之PGE2大量合成。COX2抑制剂可以显著抑制PGE2表达水平，从而抑制高糖诱导的视网膜血管渗透性及毛细血管变性[18]。此外，Dan Wu等研究发现在紫外线诱导的皮肤炎症模型中，Sal可靶向作用于COX2氨基酸残基Arg106和Tyr341上，产生氢键与COX2直接结合，进而抑制SUV照射引起的PGE2的产生，减轻炎症反应[19]。本实验发现，在浓度为35.5 mmol/L高糖作用下，rMC-1细胞中COX2、PGE2蛋白表达水平均显著上升，表明高糖环境诱导视网膜Müller发生炎症反应，而Sal处理组rMC-1细胞中COX2、PGE2蛋白表达水平均显著低于高糖组，表明Sal可以有效降低高糖作用下视网膜Müller中炎症介质COX2、PGE2的表达。
有报道表明DR的发病机制与视网膜Müller细胞凋亡密切相关，多种凋亡相关基因参与调控过程，其中包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白[20]。Bcl-2作为抗凋亡蛋白成员，可以阻止多种信号通路进而阻断细胞凋亡、延长细胞存活时间，而Bax属于促凋亡蛋白，能够介导或者促使细胞凋亡。在正常生理环境下，细胞内Bcl-2与Bax比值呈一定的比例。但高糖诱导后，视网膜Müller细胞中Bcl-2蛋白表达水平显著下降，Bax蛋白表达水平显著上升，Bcl-2与Bax比值下降，最终激活Caspases介导的视网膜Müller细胞凋亡，因此Bcl-2与Bax比值是细胞凋亡或存活的关键因素[21]。李青春等研究发现，在STZ诱导的糖尿病视网膜病变大鼠模型中，Bcl-2表达减弱，Bax表达增强[22]。此外，Hui Shan等研究发现，Sal可通过调整Bcl-2/Bax比值，改善PM 2.5诱导的支气管上皮细胞凋亡[23]。本实验研究，采用流式细胞术检测各组细胞凋亡情况，与正常对照组相比，高糖组rMC-1细胞凋亡率显著升高，而Sal能够逆转高糖作用后rMC-1细胞凋亡率的升高。通过Western blot检测各组细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达情况，高糖环境下Bcl-2表达降低、Bax表达升高。而Sal干预后，与高糖组比较Bcl-2表达升高、Bax表达降低、Bcl-2/Bax比值升高，进而证明Sal对高糖作用后的rMC-1细胞发挥抗凋亡作用。此外，在高糖诱导的rMC-1细胞中加入NS398，细胞凋亡率降低，Bcl-2表达升高、Bax表达降低。因而推断在高糖诱导的视网膜Müller细胞模型中，Sal的保护作用可能与抑制COX2/PGE2信号通路有关。
综上所述，Sal可增加高糖环境下rMC-1细胞活性，同时对高糖诱导的细胞凋亡有抑制作用。Sal的保护作用与上调Bcl-2及下调Bax的表达相关。此外，Sal可以显著降低高糖作用后rMC-1细胞中COX2、PGE2蛋白的表达，说明Sal可能通过COX2/PGE2信号通路对高糖环境下视网膜Müller细胞凋亡发挥抑制作用。Sal对高糖作用下视网膜Müller细胞的抗凋亡作用有望成为治疗DR的研究方向。
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