张 铭，宁少华，高 茜，谢 宪，程 元，梁 军*
(1. 中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所，国家林业和草原局森林保护学重点实验室，北京 100091；
2. 北京市西山试验林场，北京 100093)
松枯梢病（又名松梢枯病 shoot blight of pine）是世界范围内针叶树种上分布最广最常见的重要林木枝干病害之一[1]。自从我国自20世纪70年代末报道以来，松枯梢病已蔓延至黑龙江、吉林、辽宁、陕西、江苏、湖北、福建、安徽、江西、广东和广西等10余个省份[2]，严重危害松属（Pinus）、冷杉属（Abies）、落叶松属（Larix）、崖柏属（Thuja）、雪松属（Cedrus）、刺柏属（Juniperus）、云杉属（Picea）和黄杉属（Pseudotsuga）约8属60多种针叶树种[3]。前期研究发现的森吉木霉（Trichoderma songyi）M75菌株的无菌发酵滤液对赤松枯梢病病原菌松球壳孢菌（Sphaeropsis sapinea）具有较好的抑菌活性[4]，如果能继续优化提高森吉木霉M75的抑菌活性，这一菌株在病害防治领域的应用将大有前景。但目前还未见有关森吉木霉M75的发酵优化研究。响应面优化（Response Surface method）是最常见的应用于真菌发酵领域的研究方法[5]。这种方法比单因素试验和正交分析试验更全面，利用拟合因素和相应值之间的多元二次函数关系[6]，通过3D曲面图和2D等高线图直观的展示出各因子之间的交互作用，而非简单的线性关系[7]，其最大的优势是大大减少了试验次数，利用合理的理论范围内较少的试验数据得到最优的发酵培养条件，减轻了发酵优化的工作量[8]，也提高了优化的准确性和合理性[9]，是目前发酵领域应用最多的一种实验设计和统计分析方法[10]。本研究通过Plackett-Burman试验从众多因素中筛选得到显著影响抑菌活性的关键因子[11]，根据最陡爬坡试验使关键因子的取值逐步逼近响应面的中心点[12]，最后利用响应面分析法中的中心复合设计（CCD法）确定最优的发酵培养基配比[13]，最大程度的提高森吉木霉M75无菌发酵滤液对松球壳孢菌的抑菌活性。本研究通过PB试验、最陡爬坡以及响应面分析等多种试验方法，更全面准确的寻求最佳发酵培养基的配比及培养条件，进一步提高森吉木霉M75的抑菌效能，使生防菌株在松枯梢病的防治过程中得到更高效的利用，同时为今后大量获取抑菌活性物质提供了一定的理论基础。
1.1 供试菌株
松球壳孢菌（S. sapinea）由中国林业科学研究院菌种保藏中心提供。森吉木霉（T. songyi）M75由本实验室分离筛选获得，现保藏于中国林业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CFCC54490。
1.2 试验方法
1.2.1 森吉木霉M75无菌发酵滤液制备 将保藏的M75菌株接种于PDA固体培养基上，28 ℃活化5 d，用打孔器选取直径5 mm菌饼，接入装有250 mL PDA液体培养基的三角瓶中，180 r·min-1、28 ℃振荡培养4 d，10000 r·min-14 ℃离心10 min，弃沉淀，取上清液经0.45 μm无菌微孔滤膜过滤，于4 ℃冰箱中保存备用。
1.2.2 森吉木霉M75无菌发酵滤液对松球壳孢菌的抑菌试验方法 取1.5 mL1.2.1中得到的M75无菌发酵滤液，与加热并冷却至45～50 ℃的PDA培养基混合均匀并倾倒平板。待平板凝固后，在平板中央点接活化后的直径5 mm的松球壳孢菌菌饼，以添加无菌水制备的平板作为对照。于28 ℃恒温培养箱中培养5 d，测量松球壳孢菌的菌落直径。所有处理重复3次，抑菌率计算公式如下：
1.2.3 Plackett-Burman试验确定显著因素 利用Plackett-Burman设计[14]对影响森吉木霉M75菌株抑菌活性的8个因素进行显著性筛选，包括葡萄糖（A）、胰蛋白胨（B）、硫酸锌（C）、温度（D）、转速（E）、接种量（F）、装液量（G）和培养时间（H）。各因素分别设置两个水平，即高水平（+1）和低水平（-1），各因素水平值见表1。以森吉木霉M75发酵培养后的无菌发酵滤液对松球壳孢菌的抑菌率作为响应值（Y），设计12组试验，每组试验重复处理3次，抑菌率取3次平均值。
表1 Plackett-Burman 试验设计中各因素的水平值Table 1 Levels of the variables of Plackett-Burman design
1.2.4 最陡爬坡试验设计 在PB试验的基础上，对森吉木霉M75无菌发酵滤液抑菌活性有显著影响的3个关键因素进行最陡爬坡试验，使各因素响应值进一步逼近最优区域并确定CCD设计的中心点[15]。对所得试验数据进行统计分析确定出拟合方程后，依据系数的正负和大小确定3个显著因素的最陡爬坡，其中3个关键因素对无菌发酵滤液抑菌活性的正负值决定了爬坡方向，3个关键因素在方程中的相应系数的大小决定爬坡步长值[16]。赋响应值（Y）为森吉木霉M75无菌发酵滤液对松球壳孢菌的抑菌率（%）。共设计7组爬坡试验，各组重复检测3次，对所得结果取平均值计算抑菌率。
1.2.5 中心复合设计（Central Composite Design，CCD） 根据PB试验确定影响抑菌率的关键因素、最陡爬坡试验确定了关键因素取值的中心试验点之后，利用中心复合设计法（Central Composite Design，CCD）建立3因素5水平的响应面模型[17]，赋响应值Y为森吉木霉M75无菌发酵滤液对松球壳孢菌的抑菌率，共设计20组试验，每组试验重复处理3次，抑菌率取3次平均值。利用Design Expert 11.0对试验结果进行拟合回归分析，建立二次回归方程，通过响应面分析方法拟合出抑菌率的最大响应值，从而得到使森吉木霉M75的无菌发酵滤液达到最大抑菌活性的最优发酵培养基配方及培养条件。
1.3 模型验证与数据统计分析
将森吉木霉M75分别置于利用响应面模型拟合出的最优发酵培养基中发酵培养，每组试验重复处理3次，测定优化培养基下的无菌发酵滤液对松球壳孢菌的抑菌率，验证试验值与模型的理论值是否相一致，对模型的可靠性和有效性进行分析和验证[18]，从而得出最优的发酵培养基配比，并对优化前后森吉木霉M75无菌发酵滤液的抑菌率进行比较。采用Design Expert 11.0、SPSS 26.0和Excel 2010软件对实验数据进行统计和分析。
2.1 Plackett-Burman试验筛选显著影响因子
通过PB试验设计（N=12），对葡萄糖（A）、胰蛋白胨（B）、硫酸锌（C）、温度（D）、转速（E）、接种量（F）、装液量（G）和培养时间（H）8个因素进行二水平试验，试验设计组合及结果见表2，PB试验效应评价及显著性分析见表3。
由结果可知，在第11组试验中，森吉木霉M75发酵滤液对松球壳孢菌的抑菌效果最好，抑菌率达到77.33%（表2）。8个因子的显著性排序为温度>葡萄糖>转速>装液量>硫酸锌>胰蛋白胨>接种量>培养时间，其中温度、葡萄糖、转速的显著性位于前三位，即温度（D）>葡萄糖（A）>转速（E），且P值均小于0.05，说明这3个因素为关键因素，能显著影响森吉木霉M75的无菌发酵滤液的抑菌活性，表明其是构建响应面模型的主要影响因子，将这3个因素作为主要考虑因素进行下一步试验。其中，在选择的二水平范围内，温度（D）对抑菌活性具有负效应，葡萄糖（A）和转速（E）具有正效应（表3）。
表2 Plackett-Burman试验组合及结果Table 2 Design and corresponding results of Plackett-Burman experiment
表3 Placket-Burman试验效应评价Table 3 Evaluation of placket-Burman test effect
标准化效应的帕累托图（图1）显示从最大效应到最小效应的标准化效应的绝对值。在Pareto图中，温度（D）、葡萄糖（A）转速（E）跨越了t= 3.182的参考线，表示这3个因素在a=0.05水平上具有显著性，Pareto图结果与PB试验效应评价中的显著性结果相一致。对PB试验结果进行拟合方程回归分析，得到多元一次方程：Y=64.686 + 2.884 A - 0.417 B + 0.743 C - 5.811 D+ 2.136 E - 0.071 F - 0.862 G + 0.056 H。该方程的决定系数（R2）= 0.9913，表明该方程拟合良好。由方程可知，温度（D）的系数为负，提示温度的取值对抑菌率的影响效应为负，应逐步降低温度的取值；
而葡萄糖（A）和转速（E）的系数皆为正值，说明增大这两个关键变量的取值对抑菌率的影响效应为正，应逐步提高葡萄糖的添加量，并相应的提高转速。
图1 标准化效应的帕累托图Fig. 1 Pareto plot of standarized effects
2.2 最陡爬坡试验结果
根据PB试验中得到多元一次方程，其系数值决定了最陡爬坡试验中的爬坡方向和爬坡变化的步长值。其中葡糖糖（A）和转速（E）系数为正，说明增大这两个关键变量的取值时对响应值抑菌率的影响为正效应，应增大这两个关键变量的取值，而温度（D）的系数为负，提示温度的取值对响应值抑菌率的影响效应为负，应逐步降低温度。其他非显著性因素的取值保持不变。共设计7组最陡爬坡试验（表4），第4组中森吉木霉M75无菌发酵滤液对松球壳孢菌的抑菌率最高，即当葡糖糖（A）为2.75%，温度（D）为31 ℃，转速（E）为195 r·min-1时，抑菌活性达到最优，即在中心试验点附近，以上述条件作为CCD中心点进行响应面试验。
表4 最陡爬坡试验设计及结果Table 4 Design and corresponding results of the steepest ascent experiment
2.3 中心组合CCD设计
以PB试验中筛选出的3个关键因素和最陡爬坡试验确定的最优中心点进行森吉木霉M75无菌发酵滤液的中心复合试验设计（Central Composite Design，CCD）。其中，将3个关键因素设置为5个水平梯度（-1.68、-1、0、1、1.68），试验因素及水平如表5所示，试验设计及结果如表6所示。对表6中的试验结果进行二次回归，得到的拟合方程如下：
表5 中心组合（CCD）试验变量及水平Table 5 Variables and levels for central composite design
表6 中心组合（CCD）试验设计及结果Table 6 Design and results of central composite design（CCD）
Y= 82.02 + 3.12A + 2.23D - 2.09E - 1.59AD+ 2.56 AE + 1.95DE - 3.76 A2- 8.33 D2- 2.95 E2，其中Y为森吉木霉M75无菌发酵滤液对松枯梢病原菌的抑菌率，A为葡萄糖，D为温度，E为转速。
对拟合的回归方程进行方差分析，结果如表7所示，该回归方程模型的F值为32.93，P<0.0001，表明模型极显著，而失拟项Lack of Fit反映试验数据与模型不相符的情况，失拟项F值为2.97，P值为0.1284>0.05，表示失拟项是不显著的，这表示方程拟合较好，模型稳定且选择正确。模型决定系数R2= 0.9674，说明整体情况的96.74%可以用此模型来解释，调整后的相关性决定系数AdjR2= 0.9380，预测R2= 0.8005，进一步表明所拟合的模型具有较高的稳定性，对实际情况拟合程度良好，可以对森吉木霉无菌发酵滤液的抑菌活性的变化提供一个合适的模型，也说明各试验因素对抑菌率的影响并不是呈现简单的线性规律，而是二次函数关系。
表7 中心组合试验设计拟合模型的方差分析Table 7 Analysis of variance (ANOVA) for the quadratic model of central composite experimental design
2.4 中心组合CCD结果分析
对拟合的回归模型，使用Design Expert 11.0软件绘制响应的3D响应面分析图及对应的2D等高线图，来探究葡萄糖、温度与转速之间的相互关系对抑菌活性的影响及在得到最高响应值（即最大抑菌率时），3个因素的取值（图2～4）。2D等高线图是回归方程的图形表达形式，即用图形语言对各因素的交互关系及最优化条件下的变量进行相关解释，可直观的展示出两因素之间的相互作用及最大响应值对应的各因素的最佳水平。一般情况下3D曲面越明显弯曲，2D等高线图越陡，则说明两因素之间关系越显著，反之，若3D曲面不明显，2D等高线图越接近于圆形，则说明两因素之间关系不显著。
2.4.1 葡萄糖与温度的交互作用 如图2所示，在转速（E）处于零水平时，葡萄糖（A）与温度（D）交互的2D等高线图曲度较缓，呈近似圆形的椭圆形，表示葡萄糖与温度交互作用不显著。这与方差分析表7中的结果相一致（PA*D= 0.0763>0.05）。
图2 葡萄糖和温度交互作用效应影响森吉木霉M75抑菌活性的3D响应曲面图和2D等高线Fig. 23D response surface plot and 2D contour plot of the interaction effect of glucose and temperature on the antibacterial activity of T. songyi M75
2.4.2 葡萄糖与转速的交互作用 如图3所示，在温度（D）处于零水平时，葡萄糖（A）与转速（E）交互的2D等高线图曲度较陡，呈明显的椭圆形，表示葡萄糖与温度交互作用显著，与方差分析表7中的结果相一致（PA*E= 0.0099<0.05）。
图3 葡萄糖和转速交互作用效应影响森吉木霉M75抑菌活性的3D响应曲面图和2D等高线Fig. 33D response surface plot and 2D contour plot of the interaction effect of glucose and rotating speed on the antibacterial activity of T. songyi M75
2.4.3 温度与转速的交互作用 如图4所示，在葡萄糖（A）处于零水平时，温度（D）与转速（E）交互的2D等高线图曲度较陡，呈明显的椭圆形，表示温度与转速二者之间的存在显著的交互作用效果，与表7中的方差检验结果一致（PD*E=0.0360<0.05）。
图4 温度和转速交互作用效应影响森吉木霉M75抑菌活性的3D响应曲面图和2D等高线Fig. 43D response surface plot and 2D contour plot of the interaction effect of temperature and rotating speed on the antibacterial activity of T. songyi M75
2.5 模型验证分析
对响应面优化模型及结果可靠性进行3次重复试验验证，抑制率均值为81.50%，与模型预测的理论值十分接近，说明该模型的设计具有可靠性。而优化前的抑菌率只有74.47%，优化后森吉木霉M75的无菌发酵滤液的抑菌率提高了9.44%，松球壳孢菌在带菌平板上的菌落直径只有1.45 cm，比优化前缩减了27.5%，菌落的生长受到更明显的抑制（图5）。这也证明了利用中心复合设计法所得到的二次回归方程模型的有效性，证明了利用响应面法优化森吉木霉M75的发酵培养基和发酵条件是准确、有效且可行的。
图5 森吉木霉M75无菌发酵滤液对松枯梢病原菌的抑菌效果Fig. 5 Ihibition activities of sterile culture filtrates produced by T. songyi M75 against S. sapinea
培养条件的优化是微生物实现大批量工业化生产必不可少的环节之一，而不同的培养条件及培养基配比对微生物代谢产物的产量密切相关[19]。利用响应面分析法这种优化试验条件的科学统计方法，可以准确的利用较少的试验数据模拟出使目标对象达到最优值时的各因素的条件[20]，可以有效提高优化效率与试验进程[21]。通过改善和优化森吉木霉M75的初始培养基配比及培养条件等，使它的无菌发酵滤液对松球壳孢菌的抑菌率达到了81.50%，大大提高了抑菌活性，说明利用响应面分析法优化森吉木霉产抑菌活性物质的发酵条件是有效可行的。本研究利用PB试验筛选出关键组分，使关键因素的取值逐步逼近中心点，最后利用CCD中心复合设计找到最优点，这些因素之间并不是相互独立影响抑菌活性，他们之间的交互作用可能会使抑菌活性有所增减[22]。中心复合设计结果表明，在葡萄糖、温度与转速3个关键因素之间，葡萄糖与温度之间的交互作用不显著，说明单纯增加葡萄糖的含量，提高温度，不提升转速，液体培养基中的充足的糖分和氧气得不到有效利用，就限制了森吉木霉M75产抑菌物质的产量，影响了抑菌活性。而葡萄糖与转速两关键因子之间的交互作用显著，温度与转速两关键因子之间的交互作用也是显著的，表明在合适的转速水平上，液体培养基中的糖分和氧气能被森吉木霉M75菌株得到充分的分解和利用，提高了抑菌物质的产量，从而使此时的无菌发酵滤液对松球壳孢菌的抑制效果达到最优水平。本研究寻求到的适合森吉木霉M75发酵优化的培养基配比及培养条件，为森吉木霉M75菌株作为生防菌株，进行后续的开发利用提供了理论基础，为其生防菌剂的开发提供了理论支撑。
在实验室条件下获得一株对赤松枯梢病病原菌松球壳孢菌具有显著拮抗作用的森吉木霉菌株M75，通过响应面法明确其最优抑菌活性的发酵培养条件为：葡萄糖2.75%，胰蛋白胨1.2%，硫酸锌0.2%，马铃薯浸汁1000 mL，温度31.0 ℃、转速195 r·min-1，接种量5%，装液量180 mL，发酵培养5 d。优化后无菌滤液对赤松枯梢病病原菌的抑制率达到81.50%，比优化前提高了约10%，病原菌菌落扩展直径从优化前的2.0 cm缩减至为1.45 cm，比优化前降低了27.5%，抑菌效果得到了大幅提高。
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