赵天宇，李星辰，王法宇，何 蕊，李庆杰*
（1.长春中医药大学，长春 130117；
2.长春工业大学，长春 130012；
3.北京医药集团职工大学，北京 100079）
软枣猕猴桃（Actinidia arguta）为猕猴桃科猕猴桃属（Actinidia）的大型落叶藤本植物，生于混交林或水分充足的杂木林中，在东北地区俗称软枣子[1]。我国境内分布广泛，中国从最北的黑龙江岸至南方广西境内的五岭山地都有分布。软枣猕猴桃果实味道鲜美，富含维生素C，广泛用于生食、酿酒、加工蜜饯果脯等，其天然产量大、经济意义重大，并且有悠久的应用历史[2]。其果实营养成分丰富，具有一定的营养与保健功能。迄今对软枣猕猴桃栽培与产品加工、化学成分与生物活性研究的有关文献较多，但特征指纹图谱的研究未见报道，为了更全面控制软枣猕猴桃质量，本研究参考相关文献，采用UPLC法建立了软枣猕猴桃的特征指纹图谱分析方法。
1.1 仪器
Agilent 1290超高效液相色谱仪，含G1329A自动进样器、G4212B DAD检测器（美国，Agilent公司）；
JM-B2102型电子天平（余姚市纪铭称重校验设备有限公司）；
FA1605型电子天平（上海横平仪表厂）；
KH-100B型超声波清洗器（昆山和创超声仪器有限公司)。SVEA A132V1 C18色谱柱（50mm×2.1mm，1.7μm）。
1.2 试药
熊果酸对照品（批号：110742-201622），购自中国食品药品检定研究院；
乙腈为色谱纯；
水为自制纯水；
其他试剂均为国产分析纯。
收集不同产地的软枣猕猴桃13批，将各产地编号为S1～S13，其中，S1（批号：200901）、S2（批号：200902）产地为安图县二道白河镇；
S3（批号：200903）、S4（批号：200904）产地为蛟河市；
S5（批号：200905）、S6（批号：200906）、S7（批号：200907）产地为和龙市；
S8（批号：200908）、S9（批号：200909）、S10（批号：200910）产地为吉林市；
S11（批号：200911）、S12（批号：200912）、S13（批号：200913）产地为靖宇县。经吉林省中医药科学院南敏伦教授鉴定为猕猴桃科植物软枣称猴桃Actinidia arguta(Sieb.&Zucc)Planch.ex Miq的果实。
2.1 HPLC色谱条件
色谱柱：SVEA A132V1 C18色谱柱（50mm×2.1mm，1.7μm）；
流动相：乙腈(A)-水(B)梯度洗脱：0～2min，3%A；
2～4min，3%～5%A；
4～6 min，5%～8%A；
6～8 min，8%～15%A；
8～10 min，15%～25%A；
10～15 min，25%～90%A；
15～18 min，90%～95%A；
18～20 min，95%～3%A；
20～30 min，3%A；
流速：0.3ml/min；
检测波长210nm；
进样量5μl。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备
取适量熊果酸对照品，精密称定5.23mg，置于5ml量瓶中，加入甲醇振摇使溶解，后加甲醇定容至刻度，制成每1ml含有熊果酸1.046mg的溶液，即得对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备
取样品粉末5.0g，精密称定，置于250ml索氏提取器中，加甲醇加热回流提取5h，冷却，摇匀，滤过，水浴浓缩，定容至2ml，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.3 方法学考察
2.3.1 精密度试验[3,4]
取S1号供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样6次，记录色谱图，将图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价体系》（2012版），计算相似度，相似度均为1.000。选用熊果酸色谱峰为参照峰，计算其他共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值，共有峰相对峰面积RSD≤1.2%，相对保留时间RSD≤0.5%，表明仪器精密度良好，符合检测需求。
2.3.2 稳定性试验
取软枣猕猴桃（S1）样品溶液，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h进样，按“2.1”项下色谱条件记录色谱图。将其导入《中药色谱指纹图谱相似度评价体系》（2012版），得到各个样品的相似度，结果显示相似度均大于0.999。以熊果酸峰为参照峰，分别计算共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值。结果表明，共有峰相对保留时间及相对峰面积RSD均≤2.0%，表明供试品溶液24 h内稳定性良好。
2.3.3 重复性试验
精密称取S1号样品6份，按“2.2.2”项下方法制备供试液，按“2.1”项下方法检测，记录色谱图，将图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价体系》（2012版），得到各个样品的相似度，结果显示均大于0.999。以熊果酸峰为参照峰，计算各共有峰相对峰面积、相对 保留时间的RSD，均小于2.0%，表明方法重复性良好。
2.4 软枣猕猴桃UPLC指纹图谱的建立[5,6]
取13批软枣猕猴桃，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，另取“2.2.1”项下对照 品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别进样，记录UPLC色谱图。样品的色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价 系统》（2012版）软件进行分析，选择峰面积较大且分离度较好的S1号样品图谱作为参照图谱，进行多点校正，色谱峰全峰自动匹配，以中位数法(时间窗宽度为0.1)生成软枣猕猴桃对照特征图谱。软枣猕猴桃UPLC的对照品图谱及13批软枣猕猴桃样品特征图谱的匹配图分别见图1、2。熊果酸的出峰时间居中，峰面积较大，分离度较好，因此选取该峰作为参照峰(S)，计算13批软枣猕猴桃样品各共有峰的相对保留时间，RSD均≤0.32%，表明所得软枣猕猴桃指纹图谱可信度较高。
2.5 指纹图谱相似度评价
将各个批次的软枣猕猴桃指纹图谱分别导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）软件，对各批次样品的指纹图谱与对照图谱进行相似度评价。从图1可以看出13批软枣猕猴桃的整体图貌基本一致。13个产地的软枣猕猴桃的相似度达到了0.887，有较好的相似性，详见表1。
表1 样本相似度评价
图1 对照品熊果酸的色谱图
图2 13批次软枣猕猴桃提取物的指纹图谱
2.6 软枣猕猴桃中熊果酸含量
以熊果酸对照品为指标，用UPLC测定13批软枣猕猴桃中熊果酸的含量，其平均含量为0.0864mg/g，13批样品含量RSD值为2.77%，详见表2。
表2 13批软枣猕猴桃中熊果酸含量测定
3.1 波长选择
考察210、230、280、254、320 nm波长下的各色谱峰，210 nm波长检测到的色谱峰信息较全面，且各色谱峰的峰形及分离度较好，因此最终选择210 nm作为软枣猕猴桃UPLC指纹图谱的检测波长。
3.2 流动相选择
尝试选择乙腈-水、甲醇-水2种流动相进行UPLC梯度洗脱分析，结果显示，甲醇-水所得色谱峰较多，但部分峰的峰形、分离度较差，乙腈-水所得峰形、主要成分分离度较好，故选择乙腈-水作为软枣猕猴桃UPLC分析测定的流动相。
3.3 采集的13个不同批次的软枣猕猴桃虽有差异，但相似度均≥0.88，可作为软枣猕猴桃的质量控制方法。以熊果酸含量为指标，测定13批样品中熊果酸的平均含量为0.0864mg/g，RSD值小于3%。
综上所述，本文采用UPLC特征指纹图谱分析方法初步建立了满药软枣猕猴桃质量评价标准，对有关机构进一步研究开发满药软枣猕猴桃有一定参考作用。
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