石磊泰，曹守春，吴小红，李加，王云鹏，李玉华
中国食品药品检定研究院，北京 102629
狂犬病是一种古老的人畜共患病，除南极洲外，所有大陆均有发生，其导致的95%以上的人类死亡发生在亚洲和非洲区域。狂犬病虽然是一种可用疫苗预防的疾病，但一旦暴露，除了接种狂犬病疫苗外，及时的暴露后预防（post-exposure prophylaxis，PEP）对防止狂犬病病毒感染也非常必要。PEP可阻止狂犬病病毒进入宿主中枢神经系统，从而避免宿主感染狂犬病病毒。常见的PEP包括伤口清创和狂犬病免疫球蛋白（rabies immunoglobulin，RIG）的浸润注射［1］。RIG系用人用狂犬病疫苗免疫供血浆者，采集含高效价狂犬病抗体的血浆，经低温乙醇蛋白分离法分离纯化，并经低pH孵育灭活病毒制备的被动免疫制剂［2］。RIG在被动免疫中的作用是患者接种疫苗后开始产生自己的抗体之前，在暴露部位提供狂犬病中和性抗体，尽可能中和狂犬病病毒，阻止狂犬病病毒进入细胞，避免发生狂犬病，因此，WHO建议所有Ⅲ级暴露均应使用RIG，并给出了推荐使用剂量，人免疫球蛋白最大给药剂量应为20 IU／kg体质量，马免疫球蛋白最大给药剂量应为40 IU／kg体质量［3］。
狂犬病是一种致死性疾病，一旦出现临床症状，几乎100%致命。有证据表明，暴露于狂犬病病毒后，即使在严重暴露的情况下，及时使用狂犬病疫苗并进行正确的伤口冲洗和伤口处理，同时使用RIG，几乎可100%防止狂犬病发生［3］。
第五批狂犬病免疫球蛋白国家标准品自2002年建立以来，经多年发放使用，已达库存底线，为了对RIG和免疫血清继续进行有效的质量控制，中国食品药品检定研究院（简称中检院）着手第六批狂犬病免疫球蛋白的研制。通过对目前国内RIG质量、生产企业现状、分装、冻干设备以及企业质量控制体系等整体情况的考察，委托国药中生武汉生物制品研究所有限责任公司，遵循国家食品药品监督管理局批准的生产工艺和《生物制品国家标准物质制备和标定规程》的相关要求进行新狂犬病免疫球蛋白标准品所需候选原液的制备、半成品配制，遵循《生物制品分装和冻干规程》进行分装和冻干，规格为1.0 mL／瓶。后组织国内有资质的实验室，采用小鼠中和试验（mouse neutralization test，MNT）和快速荧光灶抑制试验（rapid fluorescent focus inhibition test，RFFIT）两种方法参加协作标定，完成了第六批狂犬病免疫球蛋白标准品（批号：250011-201306）的赋值，现报道如下。
1.1 协作标定样品 样品信息见表1。
表1 协作标定样品信息Tab.1 Data on samples for collaborative calibration
1.2 协作标定方案 由中检院设计协作标定方案，并发放协作标定作业指导书，各实验室使用统一的标准操作规范和统一的实验记录。采用MNT和RFFIT两种方法分别进行标定，每种方法提供不少于5个数据，共邀请10家有资质的实验室参与。汇总结果后经统计学分析进行赋值。根据95%可信限公式分别求出两种方法测得值的95%可信限。
1.3 均匀性检验 根据全国标准物质管理委员会编著的《标准物质定值原则和统计学原理》中对标准物质均匀性检验的要求：就均匀性好的样品而言，当总体样本数大于500时，随机抽样数不小于15个［4-5］。第六批狂犬病免疫球蛋白国家标准品物理检查合格数为6 022支，均匀性检验抽样16支，用pH值考察。使用SPSS 25.0统计学软件，采用方差分析检验均匀性，比较组间方差和组内方差来判断各组测量值之间有无系统性差异，如两者比小于方差分析的临界值，则认为标准品是均匀的。
1.4 稳定性检验 根据全国标准物质管理委员会编著的《标准物质定值原则和统计学原理》中对标准物质稳定性检验的要求：标准物质应在规定的保存和使用条件下，开展待定特性量值的稳定性检测，可通过不同温度的加速和实时稳定性试验进行［5-6］。将第六批狂犬病免疫球蛋白国家标准品分别在不同温度条件（4、25和37℃）放置不同时间（1、2、3和4周），于不同时间点分别取3支样品，于-20℃保存，待所有样本采集完成后进行统一检测，考察候选标准品的稳定性。
采用RFFIT法，将标准品用1.0 mL灭菌注射用水复溶后，进行抗体效价检测。统计学方法同1.3项，用时间变量代替瓶间变量。
2.1 协作标定结果汇总 在截止日期，10家实验室中有8家返回有效实验数据，各实验室采用MNT方法标定的几何变异系数（geometric coefficients of variations，GCV）在5.7%～21.9%之间，采用RFFIT方法标定的GCV在3.3%～9.5%之间，变异范围均可接受。见表2。
表2 第六批狂犬病人免疫球蛋白国家标准品协作标定结果汇总Tab.2 Results of collaborative calibration of the 6th national standard for rabies human immunoglobulin
2.2 协作标定结果分析与赋值 将有效数据进行汇总分析，两种方法的有效数据均为35个，MNT法协作标定的几何均值为35.4 IU／mL，95%可信限为32.6～38.2 IU／mL；
RFFIT法协作标定的几何均值为38.7 IU／mL，95%可信限为36.8～40.6 IU／mL；
两种方法95%可信限的重叠区间为36.8～38.2 IU／mL。两种方法的几何均值为37.0 IU／mL，即第六批狂犬病人免疫球蛋白国家标准品（批号：250011-2013-06）的最终赋值为37.0 IU／mL（适用于MNT法和RFFIT法）。
2.3 均匀性检验结果 均匀性检验结果见表3。数据经方差分析，根据给定的显著性水平α=0.05及自由度（15，32），查F表得临界值F0.05=2.02，经统计学分析得均匀性检验的统计量F=1.06，可得F 表3 第六批狂犬病人免疫球蛋白国家标准品均匀性考察Tab.3 Uniformity of the 6th national standard for rabies human immunoglobulin 2.4 稳定性检验结果 稳定性检验结果见表4。数据经方差分析，根据给定的显著性水平α=0.05及自由度（3，8），查F表得临界值F0.05=4.07，经统计学分析可得4℃稳定性检验的统计量F1=0.74，25℃稳定性检验的统计量F2=0.77，37℃稳定性检验的统计量F3=0.69，比较得出F1 表4 第六批狂犬病人免疫球蛋白国家标准品稳定性考察Tab.4 Stability of the 6th national standard for rabies human immunoglobulin 狂犬病病毒暴露后，除了要及时进行伤口清洗处理和接种人用狂犬病疫苗外，Ⅲ级暴露者还需使用RIG。在全球数十年的大规模应用后，RIG已被证实对PEP安全有效［7］。 RIG类制品的最早使用历史可追溯至1889年，Babes和Lepp首次记录了狂犬病免疫血清的制备。经近60年的摸索和验证，RIG的有效性在1945年最终被Habel所证实。联合使用疫苗和RIG的方式成为1966年WHO狂犬病专家咨询委员会推荐的狂犬病暴露后处置程序［8］。 人体注射狂犬病疫苗约7 d后产生抗体，约14 d后抗体能达到0.5 IU／mL的保护性水平，对于风险最高的Ⅲ级暴露者，在疫苗产生有效保护抗体之前使用RIG中和伤口内的病毒、阻止病毒进入神经组织是PEP关键的一步。因此，作为一种被动免疫制剂，RIG的质量控制尤其是其抗体效价的评价就显得尤为重要。 WHO推荐的中和抗体检测方法为MNT和RFFIT［9］，这两种方法从2015年开始同时被我国药典收录，各实验室可根据自身实验条件选择适合自己的检测方法。MNT法是最早应用的中和抗体检测方法，其基本原理是将待测样品进行系列稀释，以固定量的狂犬病病毒CVS株中和样品中的中和抗体，小鼠脑内接种检测半数保护指数（ED50），从而计算出抗体效价，该方法检验周期较长，需14 d。RFFIT是基于细胞培养的微量中和试验，基本原理是将待测样品进行系列稀释后，以固定量的狂犬病病毒CVS-11株中和样品中的中和抗体，再以培养细胞测定未被中和的CVS-11毒株，通过直接荧光抗体试验结果计算抗体效价，该方法可在48 h内完成检测，方便快捷［10］。鉴于此，本研究采用两种方法对新标准品进行协作标定。 协作标定的数据经统计学分析［11］，MNT法的赋值为35.4 IU／mL，95%可信限为32.6～38.2 IU／mL； 均匀性是标准物质的一个重要特性，标准物质是否均匀，通常随机抽取一定比例的最终包装单元，采用精密度高的检验方法，将抽取的样品在相同的实验条件下进行测定，使各样品间的差异大小由样品的不均匀程度反映出来［4］。方差分析检验是均匀性最常用的统计学方法，此方法是通过比较组间方差和组内方差的大小来判断各组测量值之间有无系统性差异，如两者比值小于方差分析的临界值，则认为样品是均匀的，反之样品是不均匀的。本研究采用复溶后能体现离子浓度的pH值来考察新标准品的均匀性，结合自由度（15，32）和给定的检验水平0.05查方差表临界值F0.05=2.02，经统计学计算均匀性检验的方差值F=1.06，可得F 标准物质的稳定性考察包括短期稳定性和长期稳定性，本标准品的长期稳定性我们会开展长期监测工作积累数据。本研究只对短期稳定性指标进行考察，短期稳定性是指标准物质在运输过程中的稳定性，通常采取放置不同时间（1、2、3和4周）和不同温度（一般放置4、25、37℃）后进行抗体效价测定来评估［6］。结合自由度（3，8）和给定的检验水平0.05查得方差临界值F0.05=4.07，经方差分析可知，4℃放置不同时间的稳定性检验统计量F1=0.74，25℃放置不同时间的稳定性检验统计量F2=0.77，37℃放置不同时间稳定性检验的统计量F3=0.69，比较得出F1 综上所述，本研究建立了第六批狂犬病人免疫球蛋白国家标准品（批号：250011-201306），完成赋值及均匀性和稳定性考察，可用于RIG类制品的质量控制。
RFFIT法的赋值为38.7 IU／mL，95%可信限为36.8～40.6 IU／mL。参照WHO对标准品赋值的指导原则［12］和第二批狂犬病免疫球蛋白国际标准品的赋值方法［13］以及NIBSC的工作建议［14］，对两种方法协作标定的结果取几何均值即为本次标准品的赋值。两种方法测得的几何均值为37.0 IU／mL，即第六批狂犬病人免疫球蛋白国家标准品（批号：250011-201306）的最终赋值为37.0 IU／mL（适用于MNT法和RFFIT法），两种方法的95%可信限的重叠区间为36.8～38.2 IU／mL。