李 莹, 赵新海*, 张庆华, 钟丽娟, 胡琴琴, 白晓瑞
(1.辽宁省微生物科学研究院，辽宁 朝阳 122000；
2.辽宁省现代农业生产基地建设工程中心，辽宁 沈阳 110033)
金针菇(Flammulinafiliformis)别名冬菇、朴蕈、绒毛柄金钱菌等[1]，隶属层菌纲(Hymenomycetes)伞菌目(Agaricales)口蘑科(Tricholomataceae)金钱菌属(Phaeocollybia)。金针菇富含蛋白质、维生素、粗纤维[2]，含有大量微量元素如锌、锰、铁、硒、铜等，以及多种人体必需氨基酸[3]，其中赖氨酸和精氨酸含量较高[4]。金针菇还含有丰富的金针菇多糖[5]，具有保护肝脏[6]、降低胆固醇、提高记忆力[7]等功效，因其质地脆嫩、口感独特而备受广大消费者喜爱。近年来，随着消费人群的不断扩大，对金针菇的需求逐年增加，金针菇工厂化栽培发展迅速，但由于原材料、人工等生产成本日益上涨，因此在减少投入的同时提高金针菇的产量对工厂化栽培而言尤为重要[8]。杨桂梅等[9]使用以玉米芯为主要原料的金针菇工厂化栽培配方，获得了良好的经济效益。金群力等[10]通过原料配方和装瓶容重分析了影响金针菇生长和子实体形成的原因。陈敏等[11]通过四因素三水平的 Box-Behnken设计进行响应面法分析，获得了在误差范围内的金针菇深层发酵菌丝体产量。贾定洪等[12]利用响应面法优化了金针菇的栽培配方，得到了贴近生产的最优金针菇栽培参数。
Plackett-Burman(PB)试验是通过比较2水平各因素之间及整体的差异性，筛选出对结果有显著影响的因素[13]。响应面分析法是对回归方程分析，优化试验条件，预测响应值，反映各因素之间对结果的交互影响，有效确定多个影响因子的最佳组合条件[14]。本研究对培养基装瓶量、灭菌前pH、接种量、搔菌深度、搔菌补水量进行探讨，并通过单因素试验、Plackett-Burman试验、响应面优化法、验证试验分析影响金针菇产量的关键因素及各个因素之间的相互作用关系,以期为工厂化栽培金针菇节约成本、增加产量提供参考。
1.1 材料
1.1.1 供试菌种 金针菇TY-01(FlammulinafiliformisTY-01)由辽宁天赢生物有限公司提供。
1.1.2 培养基 ①改良PDA液体培养基：马铃薯(去皮)200.00 g，葡萄糖20.00 g，蛋白胨5.00 g，KH2PO42.00 g，MgSO42.00 g，VB110.0 mg，水1 000 mL，pH值自然，121 ℃、30 min 高压蒸汽灭菌；
②改良PDA固体培养基：改良PDA液体培养基中加入1.8%琼脂；
③金针菇新栽培技术培养基配方[15](质量分数，%)：玉米芯 40，米糠 32，麸皮 7，棉籽壳 5，大豆皮 5，啤酒糟 5，甜菜渣 4，CaCO31，贝化石 1，水分 67。
1.1.3 主要试剂与仪器设备 葡萄糖(分析纯，沈阳新兴试剂厂)；
蛋白胨、琼脂(北京奥博星生物技术有限责任公司)；
MgSO4(分析纯，辽宁泉瑞试剂有限公司)；
KH2PO4(分析纯，天津博迪化工股份有限公司)；
CaCO3(分析纯，天津市登峰化学试剂厂)。立式高压蒸汽灭菌器(LDZF-75L，上海申安医疗器械厂)；
立式恒温培养摇床(SPH-2102，上海世平实验设备有限公司)；
电子天平(LQ-M6002，上海瑶新电子科技有限公司)；
pH计(Orion Star A211，美国Thermo Scientific)；
移液枪(Finnpipette F3，美国Thermo Scientific)；
栽培瓶规格：170 mm×100 mm，容积1 400 mL。
1.2 方法
1.2.1 金针菇TY-01液体菌种制备 将试管菌种接种于改良PDA固体平板，20 ℃培养4 d 活化，选择长势旺盛、浓密、整齐的菌丝，用直径6 mm的打孔器在距接种点20～30 mm处打孔，选取4块相同菌龄的菌丝块接入改良PDA液体培养基中，150 r/min、(22±1) ℃ 培养7 d。
1.2.2 单因素试验设计 通过对金针菇单瓶平均产量分析装瓶量、灭菌前pH、接种量、搔菌深度、搔菌补水量，明确各因素对金针菇产量的影响。每5瓶为一个处理，每个处理3次重复。湿料装瓶重量分别为960、970、980、990、1 000、1 010、1 020、1 030、1 040、1 050、1 100、1 150 g，共12个处理；
使用贝化石和1% KH2PO4调节栽培料pH值分别为6.00、6.25、6.50、6.60、6.70、6.80、6.90、7.00、7.10、7.35、7.60、7.85，共12个处理；
接种量分别为25、30、35、40、45、50、55、60、65 mL，共9个处理；
以瓶脖与瓶肩的交界处为0点，搔菌深度低于交界处为负，高于交界处为正，数值越大越接近瓶口，搔菌深度越浅。搔菌深度分别为-2、0、2、4、6、8、10、12、14 mm，共9个处理；
搔菌补水量分别为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80 mL，共14个处理。
1.2.3 Plackett-Burman(PB)试验设计 根据单因素试验结果，通过 Minitab 17 进行 Plackett-Burman 1/2 部分试验设计，每个因素取高、低2个水平，同时取3个中心点，响应值为单瓶平均产量(g)，共计19个处理，确定影响试验的显著因素(表1)。
表1 Plackett-Burman 设计因素及水平Table 1 Plackett-Burman design factors and levels
1.2.4 Box-Behnken Design(BBD)试验设计 根据 Plackett-Burman 设计结果，明确了装瓶量、灭菌前pH值、搔菌补水量为显著影响因素，以单瓶平均产量为响应值，利用 Design-Expert 12 中的 Box-Behnken 中心组合设计3因素3水平试验，共17个处理(表2)。
表2 Box-Behnken 设计因素及水平Table 2 Box-Behnken design factors and levels
1.2.5 验证试验 根据 Box-Behnken Design 设计预测结果，结合生产实际，设置适合工厂化生产使用的参数。试验组与对照组在同一生育室相邻位置，分别为15瓶，3次重复。对照组为基础条件下的同一批次常规生产栽培瓶。
1.2.6 栽培方法 ①栽培配方：参照汪勇[15]的金针菇新栽培技术培养基配方。②基础条件：装瓶量1 000 g，灭菌前pH值 6.70，接种量30 mL，搔菌深度8 mm，搔菌补水量10 mL。③打孔灭菌：装瓶后放入打孔机打孔，打孔需要料面平整，五孔呈圆形且孔型完好，料面距离瓶口15～17 mm。105 ℃保温60 min，122 ℃灭菌60 min，灭菌压力不小于0.15 MPa。灭菌结束后进入冷却室，待料内温度降至16～20 ℃时，用移液器定量接种。
④培养方法：菌丝培养温度17～19 ℃，湿度70% ～ 85%，CO2浓度(2 500 ～ 3 000)×10-6[16]，循环风机调控培养室温度、湿度和氧气均匀度；
搔菌后转入生育室，按照工厂化栽培技术参数进行菌丝恢复、出芽、抑制、生长四个阶段的管理。
1.2.7 指标测定 在生育室培养26 d后，按照菌柄长度130～140 mm，菌盖直径5～10 mm，干燥，边缘内卷的采收标准进行采收，并记录每瓶金针菇的产量。
1.2.8 数据分析 数据采用 Microsoft Excel 2019 软件处理，SPSS 25.0 软件统计分析，Duncan′s 新复极差法进行差异显著性检验。
2.1 单因素试验
由图1a可知，装瓶量为1 000 g时，金针菇子实体单瓶平均产量最高，装瓶量在960～1 000 g时，单瓶平均产量呈增加趋势，当装瓶量大于1 000 g时，单瓶平均产量下降。试验表明，装瓶量低于980 g时，出芽量少，可能是因为金针菇生长过程中栽培料的营养不足；
装瓶量超过1 100 g时，由于23 d菌丝不能长满栽培瓶，致使金针菇单瓶平均产量降低。
图1 单因素试验对金针菇单瓶平均产量的影响Fig.1 Effect of single factor test on average yield of single bottle小写字母表示处理之间差异显著(P<0.05)Lowercase letters in the figure indicate significant differences between treatments(P<0.05)
由图1b可知，灭菌前pH值 6.80，单瓶平均产量最高，pH值为6.00～6.80，单瓶平均产量呈上升趋势，pH值>7.00时，下降产量比较明显，说明金针菇子实体的形成适合弱酸环境，过酸或过碱条件均不适宜[17]。
由图1c可知，接种量为35 mL时，单瓶平均产量最高，接种量25～35 mL时，单瓶平均产量呈上升趋势，接种量大于35 mL时，随着接种量的增加，产量增加不明显，保持在相对稳定的水平，可能是由于栽培瓶中固定的养分含量和生长环境，接种量越大菌丝生长越旺盛，消耗了较多的营养，不利于产量的提高。由图1d可知，搔菌深度10 mm时，单瓶平均产量最高，搔菌深度-2～10 mm时，单瓶平均产量呈现小幅度上升，但总体保持在相对稳定的水平。试验表明，搔菌深度在-2～2 mm时，搔菌太深，伤及菌丝，影响菌丝恢复，导致出菇延后[18]；
搔菌深度在12～14 mm时，金针菇单瓶平均产量小幅度下降，切根后有散根现象，说明搔菌太浅，可能会有老菌皮残留，影响菌丝与空气和水分的接触，减少出菇量，而且搔菌浅会使料面增高，导致菇根变短，影响品质[19]。由图1e可知，搔菌补水量为10 mL时单瓶平均产量最高，补水量在15～80 mL时，金针菇单瓶平均产量呈下降趋势。试验表明，补水量大于40 mL时，出芽量减少，补水大于60 mL时，24 h内水份不能被完全吸收，过多的水分会减少原基形成，且栽培瓶内积水，使瓶内空气流通不畅，氧含量降低，影响金针菇生长。
此外，如果培养基缺少水分，也会导致菇体瘦小，产量降低。一般补水后24 h进行检查，料面湿润无积水为宜[20]。
2.2 Plackett-Burman (PB) 设计
结合单因素试验结果，将装瓶量(A)、灭菌前pH值(B)、接种量(C)、搔菌深度(D)、搔菌补水量(E) 进行 Plackett-Burman试验设计，响应值为单瓶平均产量(表3)。由图2可知，对单瓶平均产量的影响因素依次为A>B>E>C>D。由表4可知，模型为极显著(P<0.01)，A、B、E、AB对金针菇单瓶平均产量的影响达到极显著水平 (P<0.01)，BE对金针菇单瓶平均产量影响显著(P<0.05)。R2=91.47%，说明有91.47%的试验数据可以由该模型阐述。
图2 标准化效应的Pareto图Fig.2 Pareto diagram of standardization effect
表3 Plackett-Burman设计及试验结果Table 3 Plackett-Burman design and test results
表4 Plackett-Burman设计方差分析Table 4 Analysis of variance of Plackett-Burman design
2.3 Box-Behnken Design设计
Plackett-Burman试验表明接种量、搔菌深度对金针菇单瓶平均产量影响不显著，因此选择单因素试验中单瓶平均产量最高水平作为基础条件，即接种量35 mL、搔菌深度10 mm。以装瓶量(A)、灭菌前pH值 (B)、搔菌补水量(C)为变量，采用3因素3水平的响应面分析方法进行试验设计(表5)。利用Design-Expert 12软件对试验结果进行统计分析，得到回归方程：单瓶平均产量=472.85+3.21A+2.51B+2.25C-2.70AB-0.220 0AC+1.76BC-6.09A2-4.86B2-4.70C2。响应面预测的最优化条件为装瓶量1 004.05 g、灭菌前pH值 6.83、搔菌补水量11.41 mL，金针菇单瓶平均产量为473.81 g。模型分析结果P<0.000 1，极显著，失拟项P=0.825 8>0.05，不显著，说明模型的拟合度很好(表6)。模型决定系数R2=0.977 1，校正决定系数RAdj2=0.947 6，两者比较接近，表明回归方程相关性很好。C.V.(%)=0.305 6，说明变异系数较低，试验误差较小。信噪比=17.737 2>4，说明模型设计合理，可以用于结果预测。以上分析表明试验方法可靠，该模型可用于金针菇栽培的最佳工艺研究。模型中 A、B、C、AB对金针菇单瓶平均产量影响极显著(P<0.01)，BC对单瓶平均产量影响显著(P<0.05)，AC对单瓶平均产量影响不显著(P>0.05)，平方项对单瓶平均产量影响均为极显著(P<0.01)，影响单瓶平均产量因素A>B>C，与Plackett-Burman试验设计结果吻合。
表5 响应面优化试验及结果Table 5 Response surface optimization test and results
表6 响应面试验方差分析Table 6 Response surface test analysis of variance
响应面能够直接客观地阐述各因素以及因素之间的交互作用对响应值的影响[21]，3D图和等高线图反映各因素之间相互作用的强弱，响应面的曲面坡度越陡峭，等高线越偏椭圆形，说明因素的交互作用越有显著性差异。相反，曲面坡度趋于水平，等高线靠近圆形，则表示因素的交互作用没有显著性差异[22]。由图3a可以看出，响应面曲面陡峭，等高线椭圆形，说明交互作用对金针菇单瓶平均产量影响显著；
由图3b可以看出，响应面曲面趋于平缓，等高线松散，近似圆形，说明交互作用对金针菇单瓶平均产量影响不显著；
由图3c可以看出，灭菌前pH值与接种量之间交互作用的等高线密集，形状偏向于椭圆形，响应面曲面相对陡峭，说明灭菌前pH值与接种量的交互作用对金针菇单瓶平均产量影响显著。由图3a和图3c可以看出，图3a的响应面比图3c的响应面更陡峭，且图3a等高线也比图3c更偏向椭圆形，说明图3a中的交互作用强于图3c，这与方差分析结果一致。交互作用对金针菇单瓶平均产量影响为AB>BC>AC。AB、AC、BC交互作用的响应面中均存在红色顶点，说明金针菇单瓶平均产量在A、B、C这三个因素设定的范围内有极大值[23]。
图3 各因素之间的交互作用对金针菇单瓶平均产量影响的响应面和等高线Fig.3 Response surface and contour of the interaction between various factors on the average yield of a single bottlea：装瓶量与灭菌前pH；
b：装瓶量与搔菌补水量；
c：灭菌前pH与搔菌补水量a：Bottling volume and pH before sterilization；
b：Bottling volume and scratching bacteria replenishment volume；
c：pH before sterilization and scratching bacteria replenishment volume
2.4 验证试验
响应面预测的最优化条件：装瓶量1 004.05 g、灭菌前pH值6.83、搔菌补水量11.41 mL，金针菇单瓶平均产量为473.81 g。为了便于实际操作，结合单因素试验及响应面预测，将条件设置为装瓶量(1 000±5) g、灭菌前pH值(6.80±0.1)、搔菌补水量(11±1) mL、搔菌深度(10±2) mm、接种量(35±5) mL，金针菇单瓶平均产量为466.36 g，与预测值的相对误差为1.57%，说明实际值与预测值接近。对照组平均单瓶产量为454.73 g，试验组比对照组提高11.63 g，说明优化条件符合试验设计，可用于指导工厂化生产。
本研究通过单因素试验明确了装瓶量、灭菌前pH值、接种量、搔菌深度、搔菌补水量对金针菇单瓶产量的影响，并在此基础上利用Plackett-Burman和Box-Behnken Design设计进行响应面优化试验，分析各因素间的交互作用。许占伍等[24]的研究表明，装瓶量在800～860 g时，单瓶产量呈上升趋势，在860～920 g时，单瓶产量呈下降趋势，装瓶量为920 g时，培养28 d菌丝不能长满栽培瓶；
灭菌前pH值为6.25～7.01时，单瓶产量上升，pH=7.01时达到最大值，当pH=8.23时，单瓶产量下降较为明显，与本研究结果相符。对装瓶量而言，装瓶量少，生长后期会因缺乏营养使产量降低，而且由于装料疏松还会导致侧壁出菇影响品质；
装瓶量多，栽培料内空气流通性差，含氧量低，菌丝生长缓慢[25]，试验中装瓶量>1 100 g，培养23 d时，菌丝不能长满栽培瓶。金针菇菌丝在pH值3～ 8范围内均能生长[26]，试验结果表明，pH=6.80时，金针菇单瓶平均产量最高，凡军民等[27]通过贝壳粉的添加量调节栽培料pH值，金针菇产量在pH值(6.9±0.1)时最高，pH>(7.0±0.1)时产量降低，明确了金针菇适合弱酸环境。孟丽君等[28]的研究表明，金针菇液体菌种接种量为10%时，菌丝体干质量最大，12%时菌丝体干质量小幅度下降，说明随着接种量的增加菌丝体干质量并没有明显增加，与本研究结果相符。对接种量而言，接种量少，菌球分散，菌丝长满栽培瓶时间延长[29]；
增加接种量会使菌球与培养料的接触面积增加，菌丝生长较快，但接种量超过一定范围以后，菌丝生长趋于饱和，易老化[30]，不利于产量的提高，试验结果表明，接种量35 mL与55 mL的单瓶平均产量没有太大的差别，增加接种量会增加生产成本，因此选择35 mL较为适宜。
目前搔菌深度、搔菌补水量并没有详细报道，郑永德[31]认为将栽培瓶表层培养基的老菌丝去掉10 mm左右，有利于菇蕾的形成，同时补水20 mL。张宝玉等[32]视菌丝培养阶段栽培料水分散失多少而定，一般每瓶补水量为10～15 mL。本研究结果表明，搔菌深度10 mm、搔菌补水量10 mL的金针菇单瓶平均产量有最大值，可为工厂化栽培金针菇提供一定的参考。
金针菇工厂化栽培发展较为迅速，迫使企业提高金针菇的产量和品质，降低成本，以提高市场竞争能力。本研究旨在为提高金针菇产量提供理论依据，由于栽培原料本身存在一定的差异，不同生产批次之间必然有一定差异，因此，生产应用中需要根据实际的情况进行修正。
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