赵 妍,欧 翔,夏 萌,舒 浩,夏亚穆
(青岛科技大学 化工学院,山东 青岛266042)
从人类发现抗生素到使用抗生素,再到如今抗生素的广泛使用,使抗生素的发现从人类的一大革命转变成一大危机。细菌耐药性的出现,使人类的健康受到了威胁,迫使我们寻找新的抗菌途径[1-2]。近年来利用半导体产生的光热效应来进行抗菌得到了广泛研究。光热抗菌(PTT)是利用光热剂材料在近红外光的照射下产生高热,破坏细胞内的蛋白质、核酸等物质,从而影响细菌的生命活动达到杀菌的目的[3]。目前用作光热剂(PTAs)的纳米材料有贵金属、金属硫化物/氧化物、聚合物基等纳米材料等。贵金属纳米材料在吸收特定波长的光能之后,电子发生局域表面等离子共振,从而产生热量导致细菌死亡[4]。将贵金属纳米材料进行改性或者进行复合不仅提高光热性能,抗菌能力也得到一定的提高。通过形成核壳结构可以调节金纳米棒的光热转换效率,以金纳米棒为核外面包裹双层氢氧化物(GNR＠LDH)的抗菌光热剂,在808 nm 激光照射下,GNR＠LDH 的光热转换效率高达60%,在抗菌治疗伤口愈合和肿瘤治疗中都表现出了优异的效果[5]。金属硫化物硫化铜与碳基材料石墨烯复合后,经过氨基糖苷类抗生素妥布霉素进行修饰得到的抗菌剂,在近红外光的照射下对耐药性细菌有一定的杀伤性[6]。这都表明了材料的复合可更好的提高光热转换效率和抗菌效果,然而随着抗菌剂中所含元素的增加,其成本也随之增加,生物相容性也会更加的不可控。
CuInS2作为新型半导体材料,是Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ三元化合物半导体材料,具有禁带宽度稳定、光吸收系数高等优点,其合成方法简单温和,所需原料经济易得。CuInS2纳米材料目前常被用来作为太阳能电池及发光二极管等[7]。同时由于CuInS2不含有毒重金属材料,被认为是一种无毒的,潜在的临床可用的替代品,目前可用来进行生物成像等[8]。在之前的抗菌研究中还没有使用CuInS2纳米材料进行抗菌。本研究使用CuInS2纳米材料进行光热抗菌,利用CuInS2优异的光热性能促使周围温度升高,来达到抗菌的目的。
1.1 试剂与仪器
五水硫酸铜(CuSO4·5 H2O)、丙酮(C3H6O)、氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、磷酸二氢钾(KH2-PO4)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)、硫脲(TA),国药集团化学试剂有限公司;四水氯化铟(InCl3·4H2O),上海笛柏化学品技术有限公司;乙醇胺(MEA),青岛科鑫生物科技有限公司;无水乙醇(C2H5OH),天津市巴斯夫化工有限公司;LB培养基、琼脂粉,生工生物工程股份有限公司
电子天平,EL204 型,德国梅特勒科学仪器有限公司;超高速离心机,TDL-16型,凯达离心机,真空干燥箱,DZF-6050型,上海林频仪器股份有限公司;恒温震荡器,THZ-98AB 型,上海一恒科学仪器有限公司;隔水式恒温培养箱,GHP-9160型,上海齐欣科学仪器有限公司;立式压力蒸汽灭菌锅,LDZX-50KBS型,上海申安医疗器械厂;超净工作台,SW-CJ-IFD 型,苏州安泰空气技术有限公司。
1.2 样品制备
0.6 mmol五水硫酸铜(CuSO4·5 H2O)和0.6 mmol四水氯化铟(InCl3·4 H2O)混合在30 m L 单乙醇胺(MEA)中。80℃搅拌15 min形成透明的蓝色溶液。氮气置换3次,将混合物加热至140℃,溶液颜色从深蓝色变为无色。然后在流动氮气下,将硫脲(TA)溶液(1.8 mmol TA 溶于5 m L单乙醇胺中)注入前一混合物中。在注射过程中,溶液变成棕色,1 min内变成黑色。在整个过程中温度保持在140 ℃持续1 h,反应结束溶液冷却至室温,以转速5 000 r·min－1离心5 min分离产物收集沉淀,然后用乙醇和丙酮洗涤沉淀3～5次。最终的黑色产物在真空下于45 ℃干燥4 h[9]。
1.3 光热特性
将不同质量的CuInS2半导体材料超声分散在去离子水中,配置不同浓度的样品分散液(100、150、200、250、300、350、400、450、500μg·m L－1),用近红外光(808 nm,0.5 W·cm－2)照射440 s,用热电偶每20 s记录一次实时温度。改变激光灯功率密度(0.5、1.0、1.5 W·cm－2)照射样品浓度为50μg·m L－1的分散液,同样用热电偶每20 s记录一次实时温度。为了研究光热稳定性,将500μg·m L－1样品水分散液重复激光照射(0.5 W·cm－2)5个周期,热电偶每20 s记录一次实时温度。然后,使用水分散液(500μg·m L－1)一次激光开/关照射评估光热转换效率(η)[10]。
1.4 抗菌实验
将革兰氏阴性菌(大肠杆菌)及革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)菌种通过平板划线法分离出单个菌落,将分离出的单个菌落移至30 m L LB 液体培养基中,在恒温摇床37 ℃下震荡10 h。结束后,置于4 ℃环境保存。
将不同质量的CuInS2材料分散在磷酸缓冲液(PBS,p H＝7.4)中,超声分散20 min。将20μL不同浓度的CuInS2PBS分散液与180μL 菌液(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌)在96孔板中混合,然后黑暗下,恒温摇床37 ℃孵育30 min。混合物用近红外光(808 nm,0.5 W·cm－2)照射3 min,并在振荡培养箱中于37 ℃孵育20 min。对上述菌液进行平板涂布,通过平板计数法确定菌落数数量。将没有任何样品(加入20μL磷酸缓冲液)或没有激光照射的细菌溶液设置为对照组。每组做3组平行实验。通过平板计数法确定菌落数量,从而计算抗菌率[11]。
1.5 数据统计与分析
抗菌实验得到的数据在图表中以平均值±标准差表示,每组样品进行3组平行实验。进行单因素方差分析以确定样品间是否存在显著差异,p值＜0.05被认为存在显著性差异。本研究是将不同浓度的样品与Control组进行比较确定是否存在显著差异。
2.1 XRD分析
图1为样品的XRD 谱图。谱图与标准JCPDS卡数据库中报告的不匹配,因为数据库中为四方型CuInS2。根据参考文献[12]模拟的纤锌矿CuInS2衍射峰与图谱对比,显示有良好的匹配度,因此此图谱衍射峰符合纤锌矿型CuInS2。
图1 样品的XRD谱图Fig.1 XRD patterns of sample
2.2 FT-IR分析
为了进一步研究样品的结构,使用了傅里叶变换红外光谱技术得到了红外光谱图,见图2。从谱图上可以观察到,约在3 417、1 638、1 120、614、519 cm－1有明显出峰。根据参考文献[13-14],在3 417 cm－1附近的峰被指定为羟基的O—H 伸缩振动,在1 638 cm－1可以归属于与Cu(Ⅱ)相关的C＝O 键的伸缩振动,其他的3 处出峰位置1 120、614、519 cm－1可分别归属于SO2－4、CuS和Cu O。
图2 样品的红外光谱图Fig.2 FT-IR spectra of sample
2.3 XPS分析
样品CuInS2的XPS光谱见图3。图3(a)证明了Cu、In、S元素的存在。Cu 2p的区域光谱显示了一对结合能在951.6 和931.7 e V 的出峰,归属于Cu 2p 1/2和Cu 2p 3/2,并且从图中观察到在942 e V 的结合能位置没有峰出现,表示Cu＋没有被氧化成Cu2＋,结果表明Cu为＋1。In 3d的出峰在结合能452.3和444.8 eV 位置,分别对应于特征In 3d 3/2和In 3d5/2。在S 2p中,162.1和161.0 eV的出峰是S 2p 1/2和S 2p 3/2的特征峰,是二价硫的典型峰(S2－)[15],确定了材料为CuInS2。
图3 样品的XPS光谱Fig.3 XPS spectra of sample
2.4 形貌分析
图4是纤锌矿CuInS2的扫描电子显微镜照片。图4显示,形成了大量的CuInS2纳米晶体,颗粒大小均匀,约为300～400 nm。在聚集体中观察到大量的六边形板状多面体,符合纤锌矿相结构[9]。
图4 纤锌矿CuInS2的扫描电子显微镜照片Fig.4 SEM images of wurtzite CuInS2
2.5 光热特性
光热材料CuInS2通过光热特性试验得知具有良好的光热特性,在升温、稳定性以及光热转换效率上有优异的表现,见图5～图8。由图5 和图6 可见,温度随着浓度的增加而快速上升。同样,延长照射时间或提高激光的功率密度温度也随之上升。当CuInS2的水分散液浓度保持在100μg·m L－1时,激光照射(808 nm,2.0 W·cm－2)440 s后温度升高34.3℃,而纯水的温度变化可以忽略不计。通过近红外照射进行5次激光开/关循环,进一步研究了光热材料CuInS2的光稳定性。如图7,与第一次激光照射后的温度变化相比,在接下来的4个附加循环中,观察到样品溶液的温度波动可以忽略不计。根据参考文献[16],通过对光热材料CuInS2进行一次激光照射开/关循环,对特征热时间常数τs进行线性拟合(R2＝0.998 95)计算得到τs为220.40 s。进而计算光热转换效率(η)为62.398% (图8),符合前面测量的升温变化。所有这些都表明光热材料CuInS2表现出诱人的光热稳定性和良好的化学稳定性。
图5 不同浓度的CuInS2在近红外激光照射下(808 nm,2.0 W·cm－2)的温度变化Fig.5 Temperature variation of CuInS2 with different concentrations under near-infrared laser irradiation(808 nm,2.0 W·cm－2)
图6 近红外激光照射下CuInS2溶液(500μg·m L－1)的温度变化与功率密度的关系Fig.6 Relationship between the temperature change and the power density of CuInS2 solution(500μg·m L－1)irradiated by near-infrared laser
图7 CuInS2溶液(500μg·mL－1)在5次近红外激光开/关循环中的温度变化Fig.7 Temperature variation of CuInS2 solution(500μg·m L－1)in five NIR laser on/off cycles
图8 光热转换效率图Fig.8 Photothermal conversion efficiency
2.6 抗菌特性
为了研究CuInS2纳米材料的光热抗菌效果,选取了常见细菌革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌作为研究对象,光热抗菌实验结果见图9。根据不加CuInS2纳米材料组的实验结果得知,激光照射3 min的菌落数量没有明显的变化,因此激光照射3 min 对细菌的生长影响可忽略不计。根据无照射组的实验结果可知,含有CuInS2纳米材料的菌落数量与不含有CuInS2纳米材料的菌落数量相比,可忽略不计,同样黑暗条件下随着CuInS2纳米材料浓度的增加,菌落数量变化也可忽略不计。因此表明CuInS2纳米材料对细菌不会造成损害。根据FT-IR 光谱猜测可能含有CuSO4、CuS以及Cu O。以往文献[17-19]表明,CuSO4、CuS和Cu O 具有良好的生物相容性。
图9 CuInS2纳米材料的抗菌效果Fig.9 Antibacterial effect of CuInS2 nanomaterials
在激光照射情况下加入CuInS2纳米材料与加入等量PBS缓冲液相比,加入CuInS2纳米材料会导致菌落数量减少,并随着浓度的升高,菌落数量随之减少。在CuInS2纳米材料浓度达到500μg·m L－1并在808 nm,0.5 W·cm－2激光照射3 min下,对革兰氏阴性菌大肠杆菌的杀菌率达到98.61%,对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的杀菌率达到94.38%,表明CuInS2纳米材料在激光照射下有着良好的杀菌效果。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞结构不同,因此对温度的耐受性会产生一定的差异。革兰氏阳性菌的细胞壁为单层膜结构,主要成分有肽聚糖、磷壁酸和脂磷壁酸。革兰氏阴性菌的细胞壁具有双层膜结构,外膜是一层致密的带负电荷的脂多糖和脂蛋白[20]。尽管革兰氏阴性菌具有双层膜结构,但是其肽聚糖含量远不如革兰氏阳性菌,细胞壁的厚度也不如革兰氏阳性菌,因此革兰氏阳性菌的耐热性要高于革兰氏阴性菌,对CuInS2抗菌剂也表现出了不同的抗菌效果。实验结果所表示出的,CuInS2抗菌剂的抗菌活性,抗革兰氏阴性菌大肠杆菌的效果要好于抗革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌。
使用经济易得的CuSO4·5H2O、InCl3·4H2O和TA 为原料,在常压的条件下合成得到CuInS2纳米材料。并通过XRD、XPS以及SEM 等分析确定其结构形貌。经光热实验确定CuInS2纳米材料是一种良好的光热材料,光热转换效率可达62.398%,可以有效的将近红外光能转换为热能,并且具有良好的稳定性。将CuInS2纳米材料应用于抗菌,表现出可观的杀菌效果,杀菌率随着CuInS2浓度和激光功率的增加而增加。在CuInS2纳米材料浓度达到500μg·m L－1并在808 nm,0.5 W·cm－2激光照射3 min下,对革兰氏阴性菌大肠杆菌的杀菌率达到98.61%,对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的杀菌率达到94.38%,有望在临床上应用。
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