王重阳，李 洁，王梦文，陶福林，朱文涛，汪电雷
(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012；
2.肇庆学院，广东 肇庆 526061)
白坚木碱类生物碱是单萜吲哚生物碱家族中最为庞大的生物碱，因其潜在的细胞毒性，可以用来开发其抗肿瘤的作用[1-2]。白坚木碱类及其白坚木碱类二聚体，是活性的吲哚生物碱中抗肿瘤活性的基本骨架之一。最近有研究[3]从薄叶山橙中再次发现了新的白坚木碱类二聚体(10-dehydroxyl-12-demethoxy-conophylline)成分，代码命名为“wtdr-11”(见图1)，其对体外的肿瘤细胞株(HL-60，SMMC-7721、A-549、MCF-7、SW480)具有显著的抑制作用。进一步的研究表明，wtdr-11活性成分通过抑制Wnt信号通路(IC50=0.21、0.45 μmol/L)发挥其抗肿瘤活性[4]，与微管蛋白抑制剂长春碱类成分的结构、机制完全不同[5]，这提示wtdr-11对肿瘤细胞的选择性更好、对正常细胞的毒性更低。课题组前期采用超高效液相色谱-荧光法(ultra-high performance liquid chromatography-fluorescence，UPLC-FLR)测定wtdr-11在大鼠体内的药物代谢动力学[6]，wtdr-11在大鼠体内分布广泛，主要分布在肾、肺和肝这些血流量较大的器官组织内，大鼠灌胃给药的绝对生物利用度为11.55%，然而wtdr-11在人类结肠癌细胞系Caco-2细胞中吸收特性仍不清楚。为探究该生物碱在肠道的低生物利用度和吸收机制，本实验选用体外Caco-2细胞模型[7-8]模拟药物的口服给药途径，考察wtdr-11在Caco-2细胞中的吸收和转运机制。
图1 新的白坚木碱类二聚体(wtdr-11)
1.1 试药 wtdr-11(纯度>99.0%)由中国科学院昆明植物研究所提供；
胰酶、二甲基亚砜、荧光黄和青霉素-链霉素(100 IU/mL青霉素，100 μg/mL链霉素)：北京索莱宝科技有限公司；
DMEM培养基(高糖)：美国HyClone公司；
胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)：德国Serana公司；
汉克平衡盐溶液(Hank’s balanced salt solution，HBSS)：中国上海兴科生物公司；
磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer solution，PBS)：北京中商金桥生物公司；
Transwell板：美国Corning公司；
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性检测试剂盒：上海生物科技有限公司；
甲醇色谱纯：德国Merck公司；
实验水是Milli-Q超纯水，其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器 5% CO2细胞培养箱：美国赛默飞世尔公司；
倒置显微镜XSP-15CE：上海立光精密仪器有限公司；
TDL-5低速离心机：中国上海飞鸽公司；
高压蒸汽灭菌锅LDZX-50KAS：上海三申医疗器械有限公司；
电热恒温鼓风干燥：上海博讯实业有限公司；
荧光分光光度计：日本日立公司；
-20 ℃冰箱：中科美菱低温技术有限公司；
超高效液相色谱仪：美国Waters公司；
Kinetex C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)：美国菲罗门公司。
1.3 细胞株 人结肠癌细胞系Caco-2：赛齐上海生物工程有限公司，本实验所用细胞代数为10～15代。
2.1 Caco-2细胞模型液wtdr-11定量分析方法的建立
2.1.1 色谱条件及其专属性 UPLC色谱条件：Kinetex C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；
流动相：甲醇-水(75∶25)；
流速：0.2 mL/min；
检测器：FLU检测器；
荧光激发波长：330 nm；
荧光发射波长：439 nm；
柱温：25 ℃；
灵敏度：0.001 AUFS，进样量：2 μL。在该条件下wtdr-11的色谱峰与相邻基线分离度较好，峰形对称。
2.1.2 wtdr-11标准曲线建立 将wtdr-11储备液用HBSS液分别稀释成 0.1、1、2、5、10、20 μg/mL的质量浓度标准溶液，涡旋混合后，取上清液进样测定，记录峰面积。以峰面积(Y)与质量浓度(X)作线性回归，计算回归方程。
2.1.3 wtdr-11稳定性实验 精密称取wtdr-11标准品，用HBSS液稀释成10 μg/mL，置于37 ℃恒温水浴槽中保温，分别于0、0.5、1、1.5、2、3 h取样涡旋混合后，取上清液进样测定，记录峰面积。
2.1.4 wtdr-11精密度实验 取wtdr-11线性范围内1、5、10 μg/mL低、中、高3个浓度的样品，按“2.1.1”项下操作，每个浓度样品制备5份，于1 d内连续进样测定5次考察日内精密度，于1 d内进样测定1次，连续5 d进样测定考察日间精密度。
2.1.5 wtdr-11回收率实验 取wtdr-11线性范围内1、5、10 μg/mL低、中、高3个浓度的样品，按“2.1.1”项下操作并记录相应峰面积。将wtdr-11峰面积代入标准曲线中，即得wtdr-11的实际加入的浓度，以检测浓度与配制浓度之间的比例，计算回收率。
2.2 Caco-2细胞的培养 Caco-2细胞在含10%(V/V)FBS、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中于37 ℃、5% CO2、相对湿度90%下培养。每隔2 d用PBS(37 ℃，pH 7.4)冲洗细胞1次，去除未贴壁细胞，加入新鲜的完全培养液维持细胞生长。当培养瓶中细胞生长至80%～90%对数生长期时，用胰酶消化液处理，按1∶3的比例传代，本实验所用细胞代数为10～15代。
2.3 MTT法测定wtdr-11对Caco-2细胞毒性作用[9]用胰酶消化对数生长期的Caco-2细胞，加入完全培养液制成细胞悬液，以每孔5×104个细胞密度均匀接种于96孔板中，于5% CO2、37 ℃下培养24 h。wtdr-11预溶于DMSO中，再用DMEM稀释成系列浓度(0.1、1、5、10、20、30 μg/mL)溶液。每个浓度设置5个复孔。细胞与wtdr-11孵育24 h后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，37 ℃再孵育3.5 h。弃去上清液，每孔加入150 μL DMSO。将板低速轻轻摇动10 min，使甲瓒充分溶解，使用酶标仪在490 nm处测量各孔的吸光度(A)值。未接种细胞的孔作为空白对照，含有细胞但无样品溶液的孔作为阴性对照。
2.4 wtdr-11在Caco-2细胞中的摄取[10-11]
2.4.1 样品处理方法 将细胞裂解液加入等容积的甲醇中，涡旋30 s，14 000 r/min离心10 min，取上清液进样分析。
2.4.2 摄取细胞模型的建立 用胰酶消化对数生长期细胞，加入完全培养液制成细胞悬液，以3×105个细胞密度接种在12 孔板上，于5% CO2、37 ℃下培养7 d。
2.4.3 时间依赖性摄取实验 给药前，将各孔加入1 mL 37 ℃的HBSS溶液荡洗细胞表面培养基，弃去清洗液，37 ℃孵育不同时间间隔(15、30、60、90、120、180 min)后，吸出药液，HBSS荡洗3次后加入500 μL Triton X-100细胞裂解液，-80 ℃反复冻融3次，得细胞裂解液，按“2.4.1”项处理。
2.4.4 浓度依赖性摄取实验 将wtdr-11溶解于HBSS中，配制浓度为2.5、5、10、15、20 μg/mL的药物溶液。给药前，37 ℃ HBSS溶液荡洗细胞表面培养基，弃去清洗液。各孔加入1 mL不同浓度的药物溶液37 ℃孵育60 min，HBSS荡洗3次后加入500 μL Triton X-100细胞裂解液，-80 ℃反复冻融3次，得细胞裂解液，按“2.4.1”项处理。
2.4.5 pH值依赖性摄取实验 将wtdr-11溶于不同pH值(5，6，7.4，8)的HBSS溶液。给药前，37 ℃ HBSS溶液荡洗细胞表面培养基，弃去清洗液。各孔加入1 mL不同pH值的药物溶液，37 ℃孵育60 min，HBSS荡洗3次后加入500 μL Triton X-100细胞裂解液，-80 ℃反复冻融3次，得细胞裂解液，按“2.4.1”项处理。
2.4.6 温度依赖性摄取实验 将wtdr-11溶解于HBSS中，配制浓度为20 μg/mL的药物溶液。给药前，37 ℃ HBSS溶液荡洗细胞表面培养基，弃去清洗液。各孔加入1 mL pH为7.4浓度为20 μg/mL的药物溶液，分别于不同温度(4、25、37 ℃)下孵育60 min，HBSS荡洗3次后加入500 μL Triton X-100细胞裂解液，-80 ℃反复冻融3次，得细胞裂解液，按“2.4.1”项处理。
2.4.7 P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)抑制剂对Caco-2细胞吸收wtdr-11的影响 给药前，37 ℃的HBSS溶液荡洗细胞表面培养基，弃去清洗液。在孔内加入wtdr-11 (20 μg/mL)、维拉帕米(25 μg/mL)和环孢素A(10 μg/mL)药液，并与细胞共同孵育60 min(pH为7.4，温度为37 ℃)，HBSS荡洗3次后加入500 μL Triton X-100细胞裂解液，-80 ℃反复冻融3次，得细胞裂解液，按“2.4.1”项处理。
2.5 wtdr-11在Caco-2细胞中的转运
2.5.1 Caco-2细胞模型的建立 用胰酶消化对数生长期的Caco-2 细胞，加入完全培养液制成细胞悬液，以3×105个细胞密度接种在12孔Transwell板中，细胞刷状缘侧(apical，AP)加入0.5 mL细胞悬液，细胞基底侧(basolateral，BL)加1.5 mL完全培养液，放入培养箱中培养，隔天换液，重复1周，第8天开始，每天换液，培养至21 d。
2.5.2 Caco-2细胞模型单层膜完整性评价[12]通过检测膜两侧ALP活性和荧光黄的透过率判断模型是否符合转运实验要求。
Caco-2细胞膜两侧ALP活性的测定：当Caco-2细胞培养至21 d时，测定AP和BL侧ALP的活性。用空白HBSS液小心冲洗Transwell小室的上层和下层，并37 ℃孵育20 min。收集两侧的样品溶液，依照ALP试剂盒说明书测定Caco-2细胞两侧的ALP酶活性。
Caco-2细胞膜荧光黄透过量的测定：当Caco-2细胞培养至21 d时，测定Caco-2细胞中荧光黄透过量。Caco-2细胞单层用预热37 ℃的HBSS清洗3次后，AP侧加入0.5 mL 20 μg/mL荧光黄，BL侧加入1.5 mL HBSS溶液，置于37 ℃，5% CO2培养箱培养2 h后，取BL侧溶液0.5 mL，用荧光分光光度计检测荧光强度(激发波长427 nm，发射波长536 nm)，计算荧光透过率，并由公式计算荧光黄的细胞模型的表观渗透系数(apparent permeability coefficient，Papp)。
2.5.3 wtdr-11在Caco-2单层细胞膜的双向转运实验 实验前用37 ℃ HBSS液浸泡接种AP侧孔30 min，吸去孔内液体。AP→BL方向：在AP侧加入含wtdr-11(20 μg/mL)的HBSS液0.5 mL，BL侧加入空白HBSS液1.5 mL。置于37 ℃，以50 r/min振摇，并分别于60、90、120、180 min于下层采样200 μL，并补充同容积空白HBSS液，将所取样品按“2.4.1”项处理。BL→AP方向：将药物加入BL侧，AP侧加入HBSS液，其余步骤同“AP→BL方向”实验操作。
3.1 HPLC图谱专属性 结果表明wtdr-11的保留时间为4.5 min，空白HBSS液和内源物质在当前色谱条件下无干扰，符合样品分析方法的检查要求。见图2。
注：A.Caco细胞模型HBSS液；
B.wtdr-11对照品；
C.含有wtdr-11的Caco-2细胞转运液
3.2 HPLC方法学小结 HPLC测定Caco-2细胞模型中wtdr-11标准曲线为y=83 543.4x-173.28(r=0.997 3)，线性范围为0.1～20 μg/mL，在此范围内线性关系良好，相对回收率均>90%，日内和日间精密度RSD<5%，且在实验条件下37 ℃稳定，符合样品分析要求。
3.3 wtdr-11对Caco-2单细胞层的毒性作用 wtdr-11对Caco-2单细胞层的毒性结果如图3所示，在0.1～20.0 μg/mL范围内时，细胞存活率在80%以上，后续实验选择此浓度范围进行实验。
图3 wtdr-11对培养24 h的Caco-2 细胞活力的影响(n=5)
3.4 wtdr-11在Caco-2细胞中的摄取
3.4.1 不同时间对Caco-2细胞摄取wtdr-11的影响 药物以时间依赖性方式积累，wtdr-11的吸收随时间的增加摄取率缓慢降低。因此，选择60 min作为后续实验的摄取时间。见图4。
图4 不同时间对Caco-2细胞摄取wtdr-11的影响(n=3)
3.4.2 不同浓度对Caco-2细胞摄取wtdr-11的影响 药物的细胞摄取随药物浓度线性增加，在整个研究浓度范围内未观察到饱和，表明药物摄取可能是被动扩散[15-16]。因此，选择20 μg/mL作为后续实验的剂量浓度。见图5。
图5 不同浓度对Caco-2细胞摄取wtdr-11的影响(n=3)
3.4.3 不同pH值对Caco-2细胞摄取wtdr-11的影响 药物的细胞摄取量随pH值的增加逐渐增加。经方差分析，pH值为5时，细胞对药物的摄取与其他组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，其他组组间比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，表明弱碱性环境有利于药物的吸收。根据人体小肠pH值的环境，选择pH值为7.4作为后续实验的条件。见图6。
注：与其他组别比较，*P<0.05
3.4.4 不同温度对Caco-2细胞摄取wtdr-11的影响 药物的细胞摄取量随温度的升高略有增加，但差异无统计学意义(P>0.05)，表明药物摄取与温度无关。因此选择37 ℃作为后续实验的温度条件。见图7。
图7 不同温度对细胞摄取wtdr-11的影响(n=3)
3.4.5 不同P-gp抑制剂对Caco-2细胞摄取wtdr-11的影响 环孢菌素A和维拉帕米都是选择性P-gp抑制剂。在维拉帕米和环孢素A存在的情况下，药物的细胞摄取没有显著性差异，结果表明wtdr-11可能不是P-gp底物。见表1。
表1 环孢菌素A和维拉帕米对Caco-2细胞摄取wtdr-11的影响
3.5 wtdr-11在Caco-2细胞中的转运
3.5.1 Caco-2细胞模型单层膜完整性评价 使用ALP试剂盒测定Caco-2细胞两侧的ALP酶活性，AP侧ALP活性比BL侧ALP酶活性高约6.3倍。荧光黄透过量实验中，荧光黄的Papp为(6.365±0.81)×10-7cm/s，小于10-6cm/s，说明细胞膜完整性良好。
3.5.2 wtdr-11在Caco-2细胞模型中跨膜转运实验 药物的双向转运量都随着时间的增加而增加。根据细胞模型Papp的计算公式，药物从AP侧到BL侧的Papp值为58.4×10-6cm/s，从BL侧到AP侧的Papp值为82.8×10-6cm/s，推测药物在小肠吸收良好[17]。随着时间的延长，药物总体转运随时间增加，且BL侧到AP侧转运速度大于AP侧到BL侧。ER为1.42，表示转运有方向性，且小于1.5，主要属于被动扩散。见图8。
注：与BL→AP 60 min组比较，*P<0.05；
与AP→BL 60 min组比较，#P<0.05
癌症是严重威胁人类健康的复杂疾病，是世界科学领域的重要研究课题之一。作为一种新型抗肿瘤候选药物，wtdr-11具有很强的抗肿瘤活性，但其口服生物利用度差(低于20%)阻碍了其临床应用。体内实验能准确地反映药物给药后的吸收过程，但很难从细胞或分子水平上研究药物的吸收机制。Caco-2细胞模型具有细胞极性，紧密连接，与小肠上皮细胞非常相似，可以研究药物从小肠的AP侧到BL侧和从BL侧到AP侧的转运特征，用来表达药物的转运方式，建模后需经过细胞单层完整性评价才能进行转运研究。为验证Caco-2细胞单层的分化程度，对ALP活性进行检测，结果显示，培养21 d的细胞模型AP侧磷酸酶活性是BL侧的6.3倍，表明细胞极性分化已经形成。此外，本研究对细胞模型的完整性进行了评价，实验中选用荧光黄作为渗透实验药物测定了培养21 d的Caco-2细胞模型。从数据可知，荧光黄的Papp为6.37×10-7cm/s，小于10-6cm/s，说明此细胞完整性良好[18-20]，适合进行药物转运实验。本实验以Caco-2细胞模型研究wtdr-11的吸收与转运机制，在摄取试验中，摄取时间尽量选择摄取速度大的时间段，因此选择60 min作为摄取时间。细胞对药物摄取量在2.5～20.0 μg/mL范围内随着浓度增加而增加，并且在实验范围并未有饱和现象，提示摄取方式很可能是被动扩散，因此选取20 μg/mL为后续实验的浓度。在温度的影响因素中，摄取量无显著影响，因此选择37 ℃的人体温度为实验条件进行实验。在不同pH值影响的实验结果中，随着pH值的升高，药物的摄取量也逐渐增加，表明在碱性环境下可能有利于wtdr-11的细胞摄取。但考虑到人小肠实际pH值为6.8左右，因此实验选择接近此pH值的pH 7.4作为后续的实验条件。在P-gp抑制剂实验中，发现抑制剂对细胞摄取药物量并没有显著影响。
口服制剂的肠道吸收可能涉及多种转运机制，包括被动扩散、外排和摄取转运蛋白，以及细胞旁通路。研究表明，药物Papp跨越Caco-2细胞单层与其在肠上皮细胞中的吸收有关。当Papp>1×10-6时，表明药物在肠上皮细胞中吸收良好；
Papp值在1×10-7～1×10-6之间，为中度吸收。然而，Papp<1×10-7表示药物在肠道中的吸收较差。在本实验中，药物的双向转运量均随时间的增加而增加，Papp(AP→BL)为58.4×10-6cm/s，Papp(BL→AP)为82.8×10-6cm/s，均大于1×10-6，表明wtdr-11在肠道内有着较好的吸收。通常，ER值大于2的药物的转运特征被认为是转运蛋白介导的药物转运的指标。wtdr-11在Caco-2细胞间双向转运的ER值小于1.5，表明该药物的主要转运机制可能为被动转运，不涉及主动外排。因此，可以推测，wtdr-11的低口服生物利用度不是由其较差的肠道吸收和转运蛋白P-gp的外排作用引起的。这可能与该药物的半衰期有关，药物在体内消除过快，或在进入体循环前被胃肠道代谢，使药物绝对生物利用度也随之降低。为进一步阐明该生物碱在肠道处置过程，可以考虑采用体内肠灌流法和体外外翻肠囊法[21]等模型进一步探讨。本研究观察了细胞膜屏障功能对wtdr-11的影响，进一步阐述药物的肠道吸收机制，为抗癌候选药物的药理研究提供药物代谢动力学数据支持。