李晓慧，王琦，张琛，岳宁，李敏洁，邵勇，邵华，郑鹭飞，王静，金芬
（中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京 100081）
蔬菜质量安全与广大民众的身体健康和生命安全息息相关。黄瓜作为我国重要的蔬菜作物，种植面积达125.8×104hm2，产量为7 033.9×104t，生产规模位居世界第一[1]。然而黄瓜易遭受病虫害侵害[2]，农药仍是目前防治黄瓜病虫害最有效的措施之一[3]。因此，黄瓜中农药残留也成为消费者关注的主要问题之一。山东是我国蔬菜的主要产区和销区，开展从生产基地到批发市场、农贸市场和超市等流通环节中黄瓜的农药残留调查及膳食暴露评估，摸清主要危害因子的类型和风险水平，对保障我国蔬菜产品质量安全具有重要意义。
利用保留指数-气相色谱-串联质谱法，结合数据库分析是近年来发展起来的一种非常有效的高通量筛查方法，已在果蔬及中草药等风险监测、隐患识别及未知风险筛查中应用。Tan等[4,5]采用保留指数-气相色谱-串联质谱法分别快速筛查中草药和西洋参中74种和130种农药残留；
高会兰等[6]建立了基于保留指数原理结合气相色谱-三重四极杆质谱法，构建了蔬菜中257种农药残留快速筛查法。张鹏云等[7]采用顶空固相微萃取技术，利用气相色谱-三重四级杆串联质谱退卷积定性系统，结合保留指数法分析了杭白菊挥发性成分，共检出88种化合物。
目前，我国针对蔬菜中已知农药残留的靶向分析，已建立了成熟可靠的检测方法和体系[8,9]，而针对样品中不可预知的农药及代谢物，亟需建立快速的筛查技术。此外，零星的采样并不能反映潍坊地区农药残留的真实情况和风险高低，从生产环节到流通环节的全程风险评估研究缺乏。采用保留指数结合气相色谱-三重四极杆质谱法，自建农药残留数据库，对黄瓜样品进行623种农药及代谢物的快速定性筛查，然后通过标准物质对检出农药及代谢物再进行验证，定量测定了山东潍坊地区从生产基地到不同流通环节的农药残留；
并结合农药残留慢性和急性膳食摄入风险评估方法、残留风险排序矩阵对农药残留风险进行评估和排序，明确了黄瓜样品中需要重点关注的高风险农药的类型，为保障农产品质量安全和人民健康提供参考依据。
1.1 试验材料
1.1.1 样品采集与制备
2020年11月于山东潍坊地区采集25个种植基地和25个市场（农贸市场、超市、便利店、合作社各10个）的黄瓜样品，共392个样品。对采集样品的名称、采集地点、采集日期、采样人等相关信息进行登记并编号，去除泥土等杂质，按照GB 2763-2021《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》附录A取其可食部分，进行匀浆混匀后，装入自封袋，于-20 ℃的深加工冷库中冷冻保存待测。
1.1.2 材料与试剂
正构烷烃（C7-C40，10 mg/L），AccuStandard；
N-丙基乙二胺（40～60 µm PSA），天津博纳艾杰尔科技公司；
正己烷（色谱级），美国Fisher公司；
乙腈（色谱级），美国Fisher公司；
柠檬酸钠、柠檬酸二氢钠无水硫酸镁和氯化钠（均为分析纯），北京化工厂；
0.22µm有机系滤膜，天津博纳艾杰尔公司；
55种农药及代谢物标准品：购自First standard。
1.1.3 仪器与设备
GCMS-TQ8040三重四极杆气质联用仪，日本岛津企业管理有限公司；
电子天平，瑞士Mettler Toledo公司；
涡旋混匀器，美国Scientific industries公司；
高速冷冻离心机，美国Thermo公司。
1.2 方法
1.2.1 样品前处理
参照国家标准方法GB 23200.113-2018，称取10 g黄瓜试样（精确至0.01 g）于50 mL塑料离心管中，加入10 mL乙腈剧烈振荡1 min。加入4 g无水硫酸镁、1 g氯化钠、1 g柠檬酸钠、0.5 g柠檬酸二氢钠，剧烈振荡1 min，4 200 r/min离心5 min。准确吸取3 mL上清液加入到内含450 mg无水硫酸镁、75 mg PSA的15 mL塑料离心管，涡旋混匀1 min，4 200 r/min离心5 min，准确吸取2 mL上清液于10 mL试管中，40 ℃水浴中氮气吹干，加入正己烷复溶，过0.22 μm有机系滤膜后用于测定。
1.2.2 色谱、质谱条件
色谱条件：色谱柱：DB-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 µm）；
色谱柱温度程序：50 ℃保持1 min，然后以25 ℃/min程序升温至125 ℃，再以10 ℃/min升温至300 ℃保持15 min；
载气：氦气，纯度≥99.999%；
流速：1.69 mL/min；
进样口温度：250 ℃；
进样量：1 µL；
进样方式：无分流进样。
质谱条件：电子轰击源：70 eV；
离子源：EI；
离子源温度：200 ℃；
GC-MS接口温度：250 ℃；
碰撞气为氩气；
溶剂延迟时间为1.5 min。
1.2.3 保留指数-气相色谱-串联质谱快速定性筛查方法
式中：
RI——保留指数，
tR——保留时间，min；
X——待分析的化合物；
Z，Z+1——待分析物前后的两个正构烷烃的碳原子数，即tR(Z)＜tR(X)＜tR(Z+1)。
用正己烷准确配制质量浓度为5 mg/kg的C7-C40正构烷烃的溶液，进行全扫描，获得C7-C40正构烷烃TIC图（图1）；
依据公式（1），带入对应的正构烷烃的保留时间，计算623种农药及代谢物的保留指数RI。以623种农药及代谢物为目标物，建立质谱多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）方法，结合自建农药残留数据库，计算出待测目标农药的预测保留时间及质谱分析参数，采用保留时间和离子比率对黄瓜样品中的农药残留及代谢物进行定性筛查。
图1 C7-C40正构烷烃混合标准品总离子流图Fig.1 Total ions chromatogram of C7-C40 n-alkane mixture standard
1.2.4 气相色谱-串联质谱定量分析方法
对于定性筛查的结果，采用标准品进行验证。准确称取10 mg（精确至0.1 mg）各农药标准品，根据标准品的溶解性选丙酮或正己烷等溶剂溶解并定容至10 mL，配制10 mg/L储备液。取黄瓜空白样品，按1.2.1的方法制得空白基质溶液，配制浓度为0.01、0.02、0.05、0.10、0.2、0.5 mg/kg的基质匹配混合标准溶液，并按1.2.2中的色谱、质谱条件进样，绘制基质匹配标准曲线，采用外标法对定性筛查出的农药及代谢物进行定量分析。
1.2.5 慢性和急性膳食摄入风险计算方法
慢性膳食摄入风险（%ADI）使用以下方程式：
式中：
STMR——规范试验残留中值，取平均残留值，mg/kg；
0.01854[10]——居民日均黄瓜消费量，kg；
ADI——每日允许摄入量，mg/kg；
bw——体重，单位kg，按60 kg[10]计。
%ADI越小风险越小，当%ADI≤100%时，表示风险可以接受；
反之，当%ADI＞100%时，表示有不可接受的风险。
急性膳食摄入风险（%ARfD）使用方程式（4）和（5）：
式中：
IESTI——估计短期摄入量，kg；
HR——最高残留量，mg/kg；
LP——大份餐，kg，按0.42469[10]计；
ARfD——急性参考剂量，mg/kg，
bw——体重，kg，按60 kg计。
%ARfD越小风险越小，当%ARfD≤100%时，表示风险可以接受；
反之，%ARfD＞100%时，表示有不可接受的风险。
1.2.6 风险排序
参考Fang等[11]所采用的风险排序矩阵对黄瓜中农药残留风险排序，其中毒性指标代替药性指标，膳食比例、农药毒效、农药使用频率、高暴露人群、残留水平等5项指标均采用原赋值标准[12]，各指标的赋值标准见表1。毒性采用急性经口毒性，毒效采用ADI值，膳食比例指中国黄瓜暴露量占总膳食的比例，农药使用频率（FOD）根据公式（6）计算，各农药的残留风险得分S用公式（7）计算，最终每种农药的残留风险得分以该农药在所有样品中残留风险得分平均值计算。S值越高，残留风险越大。
式中：
FOD——农药使用频率，
P——果实发育日数，（黄瓜从开花到果实成熟所经历的时间，单位d，按40 d[13]计）；
T——黄瓜发育过程中使用该农药的次数；
A——毒性得分；
B——毒效得分；
C——黄瓜膳食比例得分；
D——农药使用频率得分；
E——高暴露人群得分；
F——残留水平得分。
表1 黄瓜农药残留风险排序指标得分赋值标准Table 1 Evaluation criteria for ranking index scores of pesticide residue risk in cucumber
1.2.7 数据处理
MRL和ADI均为GB 2763-2021标准中给定数值。依据相关检测标准规定，残留含量＞1.00 mg/kg时，计算结果保留3位有效数字；
残留含量＜1.00 mg/kg时，计算结果保留2位有效数字。检出率、超标率等统一保留两位小数。
2.1 黄瓜中农药及代谢产物的定性筛查分析
采用保留指数-气相色谱-串联质谱联用法对黄瓜中623种农药及代谢物进行快速定性筛查，发现392份黄瓜样品中均存在不同程度的农药残留，共筛出55种农药及代谢物。其中，26种为我国登记农药，29种为我国未登记使用农药，检出率分别为1.02%～92.09%和0.26%～63.78%。从单个样品检出农药的数量看，农药多残留现象较突出，大部分样品检出农药数量为6～15种，占比92.39%，而检出农药数量少于5种和大于15种的黄瓜样品占比分别为4.06%和3.56%。值得注意的是，不同环节单个黄瓜样品中农药检出的数量分布存在明显差异。如图2所示，采自生产基地的黄瓜样品检出农药数量相对较少，为0～20种（图2a），检出农药数量高于15种的样品仅占4.08%；
而采自流通环节的黄瓜样品检出农药数量较多，为0～25种（图2b），检出农药数量高于15种的样品占33.5%。与生产环节（4.08%）相比，流通环节（33.5%）单个黄瓜样品的多残留现象更严重，这可能与黄瓜采后收、贮、运环节缺乏有效监管有关。有研究表明，在果蔬采后采用杀菌剂浸果、涂布、喷洒可以起到防腐保鲜的作用[14]，如烯酰吗啉处理椪柑可有效防治贮藏期褐腐病[15]；
咯菌腈[16]、吡唑醚菌酯[17]可有效控制苹果采摘后由真菌引起的腐烂病；
嘧菌酯[18]用于处理收获后的柑橘可防治储运期间的腐败变质；
戊唑醇、百菌清等杀菌剂用于卷心菜采后灰霉病的有效控制[19]；
抑霉唑、多菌灵等用于提高蒜薹贮藏期[20]。黄瓜在采后收、贮、运环节的农药残留应引起关注。
图2 黄瓜样品中农药及代谢物残留分布Fig.2 Residue distribution of pesticides and metabolites in cucumber samples
表2 黄瓜中55 种农药及代谢物的检出情况Table 2 Detection of 55 pesticides and metabolites in cucumbers
续表2
2.2 黄瓜中农药及代谢产物的残留水平
在采用保留指数-气相色谱-串联质谱联用法对黄瓜样品中不可预知的农药残留进行初筛后，采用标准品对所有检出农药进行了定性验证和定量分析，结果如表2所示。为考察方法的准确度和精密度，对试样进行了加标回收率实验，在已知空白试样中分别添加三个水平（1、0.5和0.2 mg/kg）55种农药混合标准溶液（n=6），农药的回收率在68.02%～119.90%之间，相对标准偏差小于15.1%。
55种检出农药及代谢物的残留浓度范围为0.010～5.33 mg/kg，其中生产环节和流通环节的黄瓜样品中农药残留浓度存在明显差异。最高浓度出现在基地黄瓜样品中，为炔丙菊酯，检出浓度为5.33 mg/kg；
与GB 2763-2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》相比，有5种农药存在超标现象，即螺螨酯、硫丹、甲霜灵、醚菌酯、哒螨灵，超标率分别为2.30%、1.02%、0.51%、0.26%、0.26%，超标浓度范围分别为0.072～0.30、0.051～0.12、0.50～0.76、0.50、0.11mg/kg。Ma等[21]对湖北省黄瓜中哒螨灵进行检测，叶片中含量高达2.19 mg/kg，但果实未检出；
Ramadan等[22]对沙特阿拉伯的黄瓜进行检测甲霜灵检出率达16.67%，但均未超过欧盟的最大残留限量；
Wang等[23]对浙江福建江苏三省黄瓜样品进行检测，均未检出醚菌酯；
本研究检出超标农药中，其中硫丹为高毒禁限用农药，而螺螨酯和醚菌酯未在我国黄瓜中登记使用，其检出可能与农业投入品的违法使用、隐性添加和未严格遵守采收间隔期等有关。总体看，本研究黄瓜样品中农药残留超标现象较先前研究突出，可能与冬季黄瓜均为大棚设施栽培，棚室内温度高和湿度大，易受病害侵袭，农药施用更加频繁有关。
55种检出农药及代谢物中有19种（占比34.55%）不在现行国标方法（G B 2 3 20 0.11 3-2 0 18和GB 23200.8-2016）的检测范围内。值得注意的是，在这19个农药中，氟吡菌酰胺的检出率为28.57%，这与崔春艳等[24]的结果相类似，在京津冀地区的黄瓜样品中氟吡菌酰胺的检出率高达1 0 0%，浓度为0.06～14.41 mg/kg。氟吡菌胺的检出率为30.36%，浓度为0.02～0.11 mg/kg，Vieira等[25]在巴西的黄瓜样品中也检出未登记成分氟吡菌胺，浓度为1.50 mg/kg。敌菌丹虽未在我国黄瓜中登记使用，但也呈现了高检出率（63.78%）。此外，通过该方法还筛查出氟吡菌胺[26]、克菌丹[27]、百菌清[28]、乙烯菌核利[29]的代谢物2,6-二氯苯甲酰胺、四氢邻苯二甲酰亚胺、五氯苯腈和3,5-二氯苯胺，其浓度分别为0.03～0.07、0.05～0.12、0.040～0.041和0.03～0.06 mg/kg。虽然这些代谢物的检出浓度较低，但由于其毒性均高于其母体[30-33]，也应引起关注。Manikrao等[34]、Shi等[35]在对印度和中国的北京、河南及安徽等地黄瓜的检测中，也发现了类似的结果，2,6-二氯苯甲酰胺的检出浓度小于0.05 mg/kg，与本研究相当。
而在检出的29种未登记农药中，其中12种农药，即甲氰菊酯、多效唑、甲草胺、敌菌丹、四氟醚唑、呋虫胺、醚菌酯、嘧菌胺、茚虫威、残杀威、氟环唑、噻草酮，国际食品法典委员会（Codex Alimentarius Commission，CAC）、欧 盟 委 员 会（European Commission）和日本已制定最大残留限量，而我国均未制定其在黄瓜中的最大残留限量[36]。对照国外限量，敌菌丹、多效唑、甲草胺、甲氰菊酯、呋虫胺存在部分超标现象，超标率分别为63.78%、34.69%、24.49%、2.81%、1.02%，在我国黄瓜产品出口时，应重点关注这些农药。
2.3 农药残留慢性和急性膳食摄入风险
如表3所示，55种农药及代谢物残留的慢性膳食摄入风险%ADI值为0.05%～11.88%，平均值为1.56%，远低于100%；
总体上看，黄瓜中农药残留慢性膳食摄入风险较低。%ADI值最高为11.88%（异丙威）。对有ARfD信息的27种农药及代谢物进行急性膳食摄入风险评估，%ARfD为0.01%～52.66%，平均值为4.57%，均远低于100%，其中腐霉利的%ARfD值最高为52.66%。腐霉利、噻唑磷、氟硅唑、联苯三唑醇、溴虫腈5种农药的%ARfD大于5%（5.54%～52.66%）；
吡唑醚菌酯、硫丹、噁唑菌酮、戊唑醇、联苯菊酯、残杀威、苯醚甲环唑、哒螨灵、咪鲜胺、甲霜灵、粉唑醇11种农药的%ARfD为1.02%～4.52%，介于1%-5%之间，而呋虫胺、茚虫威、霜霉威、三唑酮、多效唑、氟吡菌胺、烯酰吗啉、氟吡菌酰胺、肟菌酯、甲草胺、噻草酮11种农药的%ARfD最低，均小于1%，这表明黄瓜农药残留急性膳食摄入风险可以接受，且风险很低。李运朝等[37]对河北黄瓜中对腐霉利、烯酰吗啉、吡唑醚菌酯等8种杀菌剂进行膳食暴露评估，残留慢性和急性膳食摄入风险均远低于100%；
Ozgur Golge等[38]对土耳其的黄瓜样品中170种农药进行检测并进行急性膳食摄入评估，风险值均远低于100%，均不会对一般人群的健康造成不可接受的风险。
表3 农药及代谢物残留慢性风险评估和急性风险评估Table 3 Chronic and acute risk assessment of pesticide and metabolites residues in cucumbers
续表3
图3 黄瓜中40种农药的残留风险排序Fig.3 Ranking of residue risk of 40 pesticides in cucumber
2.4 农药残留风险排序
由于五氯苯腈、3,5-二氯苯胺、炔丙菊酯、驱虫特、噻氟菌胺、氯啶、四氢邻苯二甲酰亚胺、等7种农药的毒性数据缺乏，敌菌丹、菌核净、2,6-二氯苯甲酰胺、呋虫胺、氟环唑、嘧菌胺、残杀威、猛杀威等8种农药无ADI值，无法计算其残留风险。本研究仅对剩余40种检出农药残留的风险得分进行排序。由《中国居民营养与健康状况监测综合报告（2010-2013）》可知，黄瓜摄入量占总膳食的比例为18.5%，由表1确定黄瓜膳食得分（C）为1；
经查询中国农药信息网，农药在黄瓜发育过程中使用次数（T）最多不超过3次，根据公式（6）可得农药的使用频率（FOD）低于7.5%，使用频率得分（D）为1；
所有检出农药高暴露人群得分（E）统一赋值为3。根据公式（7）计算，风险排序结果如图3所示：第1类风险得分≥20，为高风险农药，有22种（占比55%），主要为硫丹、噻唑膦、哒螨灵等；
第2类风险得分为20～15，为中风险农药，仅有2种（占比5%）；
第3类风险得分均＜15，为低风险农药，共有16种（占比40%），主要为腐霉利、咯菌腈、烯酰吗啉等。
本研究中高风险农药占比（60%）高于马新耀等[13]对山西省黄瓜农药残留进行风险排序时中高风险农药占比（30.8%），可能与本研究采用保留指数法对黄瓜样品中农药及相关化学品进行非靶向筛查，扩大了农药筛查范围，农药覆盖种类更广，而上述研究仅针对常用农药靶向筛查，覆盖农药种类有限（75种），导致部分潜在风险因子未被识别、监测有关。本研究中检出51种农药主要为杀菌剂（56.4%）、杀虫剂（21.57%）和除草剂（7.84%），其中高风险农药的类型为杀菌剂、杀虫剂、除草剂和杀螨剂，分别占61.9%、33.33%、9.52%和9.52%。北方设施黄瓜常见的病虫害主要为霜霉病、灰霉病、细菌性角斑病等真菌性或细菌性疾病[39]以及蚜虫、斑潜蝇和粉虱等[40]，这与本研究检出主要农药的类型相一致。因此，针对上述常见的病虫害建议采用低毒已登记农药如腐霉利、霜霉威、烯酰吗啉等杀菌剂和灭蝇胺、阿维菌素等杀虫剂防治。
本研究采用保留指数-气相色谱-串联质谱联用快速筛查法结合标准品确证定量的分析策略，对山东潍坊黄瓜样品中623种农药及代谢物进行筛查分析，扩大了现有农药残留风险筛查的范围，检出农药及代谢物55种，其中19种为现有国标方法未覆盖的农药，提升了风险筛查的能力和准确度。筛查结果表明该地区黄瓜样品中农药多残留较为普遍，但总体上农药残留的慢性和急性膳食摄入风险均较低，流通环节单个黄瓜样品的多残留较生产环节更严重，这一现象值得关注，从基地到市场的“三前环节”存在风险点，应加强监管。
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