刘 盼，江良荣，黄荣裕，黄育民，王侯聪，郑景生
（厦门大学生命科学学院，福建厦门361102）
随着生活水平提高，人们开始注重营养保健，对功能性大米尤其是种皮富含微量元素和花青素的红米、紫米和黑米有更多需求。红米有活血补血、消肿散淤、润肤止痒等功效，具有较高营养价值和药用价值，在民间多被称为神仙米、补血米、长寿米、药米等。遗传研究结果显示，水稻的红色种皮性状大多数由1对显性基因控制［1-3］，该基因位于第7号染色体上［3-7］。Sweeney 等［4］研究表明，Rc 基因编码一个具有bHLH结构的Myc类转录因子，白米品种Rc基因的第6外显子上有14bp的缺失，导致花青素无法合成而使种皮呈现白色。传统的红米品种株型差、产量低、口感不好，因此选育优质高产的红米品种引起育种者重视，并育成许多优质高产的红米品种如赣晚籼33号［8］、高优红88［9］、南两优红3号［10］等。然而，采用传统育种技术培育红米新品种时，如用回交方法难以在回交世代选择到红米种皮基因型杂合或纯合的单株，在分离后代难以选出红米种皮基因型纯合的株系，降低育种效率。然而，分子标记辅助育种技术不受外界环境条件影响，而且有较高选择准确性和育种效率，因而受育种家重视。为快速、准确选育红米水稻新品种，提高育种效率，本研究应用水稻第7号染色体上红米品种和白米品种种皮的基因序列差异，设计可用于准确鉴别水稻红米种皮基因型、呈共显性的分子标记并进行验证，为应用分子标记辅助快速、有效选育红米水稻新品种提供技术支撑。
1.1 研究材料和田间种植
研究材料为前期引进或保存的种质资源 （表1）：红米品种17个、白米品种7个和紫（黑）米品种6个及用白米品种蜀恢527和红米品种培杂191杂交的部分F2分离群体单株，各材料均种植于厦门大学龙海基地。种植的株行距20 cm×20 cm，每行种8株，单本插植，田间管理与一般大田相同。成熟时各材料分别单株收获，晒干后用糙米机脱壳后观察糙米种皮颜色。
表1 不同水稻品种的种皮颜色及红米种皮的分子标记检测分析
1.2 水稻红色种皮基因的分子标记设计
利用水稻7号染色体上的红色种皮与白色种皮品种间的碱基序列差异，即白米种皮的第6外显子缺失14bp，采用Vector NTI Advance 11软件，设计3对可用于辅助选择区分水稻红色种皮性状的共显性分子标记（表2），然后用表1中的30个不同种皮颜色的水稻品种及R527/培杂191组合的F2群体中随机选择已鉴定种皮颜色的部分单株，用于验证这3对红米种皮分子标记。
表2 水稻红色种皮性状的功能性特异性分子标记引物
1.3 DNA提取
各材料取分蘖期的嫩叶于2 mL离心管中，带回室内冷藏于-20℃冰箱或冰柜，参照王珍等［13］的方法快速提取DNA。
1.4 PCR反应体系和程序
PCR反应体系和反应程序具体参考郑景生等［14］的方法。
1.5 PCR产物扩增检测
PCR扩增产物的分离检测采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用快速银染法进行染色，记录各条带的基因型后照相保存，具体参考郑景生等［14］的方法。
2.1 水稻红色种皮性状的分子标记可准确鉴定不同品种的种皮颜色
30个水稻品种稻谷脱壳后观察其糙米种皮颜色，看出：编号为1-17的水稻品种种皮为红色，编号为18-24的水稻品种种皮为白色，编号为25-30的水稻品种种皮为紫色或黑色（表1）。用本研究设计的水稻红色种皮性状的分子标记HS-1、HS-2和HS-3对这30个水稻品种的DNA进行PCR扩增和凝胶电泳检测（表1、图1），结果表明：分子标记HS-1、HS-2、HS-3均能扩增出特异性条带，红米品种的条带分别为193bp、106bp、131bp，非红米品种（白米或紫米、黑米）的条带分别为179bp、92bp、117bp。将各水稻品种的分子标记DNA扩增条带结果与其糙米种皮颜色相比较，发现分子标记HS-1、HS-2和HS-3对30个水稻品种的种皮颜色DNA鉴定结果与表型的鉴定结果相同。可见，水稻红色种皮性状的分子标记HS-1、HS-2和HS-3均可用于鉴定水稻红米品种和非红米品种。
图1 红米种皮分子标记HS-1、HS-2和HS-3在不同水稻品种的电泳条带
2.2 水稻红色种皮性状的分子标记可准确鉴定红米品种杂交后代分离群体单株的种皮颜色
为进一步验证水稻红色种皮选择的分子标记HS-1、HS-2、HS-3是否能准确鉴定红米品种杂交后代群体单株的糙米种皮颜色，从白米品种R527与红米品种培杂191 的杂交后代（F2）分离群体中，随机选取种皮的颜色已经鉴别的部分单株的DNA用于PCR扩增、凝胶电泳检测，图2结果看出：HS-1、HS-2、HS-3对R527/培杂191 F2代分离群体单株均能扩增出3种不同基因型的条带，即基因纯合显性的红米、基因纯合隐性的非红米及基因杂合型的红米，各单株糙米种皮颜色的DNA鉴定结果与其表型相吻合。说明水稻红色种皮性状的分子标记HS-1、HS-2和HS-3均可准确鉴定红米杂交后代群体中各单株的糙米种皮颜色基因型，可快速准确选择出红米种皮基因型纯合的单株。
图2 分子标记HS-1、HS-2和HS-3在R527/培杂191 F2群体的部分单株电泳条带
由此可见，水稻红色种皮性状的分子标记HS-1、HS-2和HS-3都可以准确鉴定水稻红色种皮性状，快速从杂交后代群体中筛选出红米种皮基因型纯合的株系。但从这3对标记的PCR扩增稳定性、扩增产物电泳所需时间和电泳条带清晰度进行综合分析看出，HS-2具有扩增稳定、条带清晰、条带间差异最明显、引物片段小、电泳时间短的特点。综上，研究认为，HS-2是分子标记辅助选育水稻红米品种较为可靠的标记引物，可提高选育红米品种的效率。
分子标记辅助选育已成为当前选育作物新品种的一项重要技术，它在分子水平上对目标性状的选择不受其它基因或环境条件的影响，可避免等位基因间的显隐性关系干扰，选择结果很可靠，且可在育种的早世代完成，尤其是对感官难以鉴别的性状，如抗病、食味品质、香味等具有较高的选择效率，从而大大缩短育种周期。目前该技术已在水稻抗病虫［15-17］的目标性状选择取得良好效果。红米具有重要的营养保健功能而受到人们重视，为加快红米育种效率，魏文嵩等［11］、张亭亭等［12］设计出可对红米品种进行分子标记选择的引物，有利提高红米品种的育种效率。
本研究基于水稻第7号染色体上红米与非红米种皮基因序列差异，即白米品种第6外显子缺失14bp，设计出3对水稻红色种皮分子标记HS-1、HS-2和HS-3（表2），这3对标记可准确鉴定红米和非红米水稻品种、准确区分红米杂交后代群体红米种皮纯合显性、纯合隐性和杂合基因型的植株，对有效选育红米新品种具有很大帮助。其中，HS-2具有扩增稳定、条带清晰、电泳时间短等特点而成为本研究推荐的MAS选择红米品种的首选分子标记。
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