张翔，王祖峰
(农业农村部全国水产技术推广总站，北京 100125)
蛋白质是细胞功能的重要执行者，绝大多数蛋白均需要折叠形成正确的三维构象才能正常行使功能。蛋白的折叠过程复杂而精密，对外界环境和细胞内环境的变化均较敏感，有些情况下会发生错误折叠或形成有害的蛋白聚集体。为保障生物体的正常运转，细胞中各蛋白都应正确地合成、折叠、组装及行使功能，即维持细胞的蛋白内稳态(protein homeostasis)。为此，生物进化出了主要由两部分组成的蛋白质量控制系统(protein quality control system)：其一是帮助蛋白折叠及构象修复的分子伴侣网络，由热休克蛋白为主的分子伴侣蛋白及其调控因子构成；
其二是蛋白降解系统，主要包括自噬通路和蛋白降解相关的泛素-蛋白酶体系统[1]。
细胞的分子伴侣网络涉及几类进化上保守的热休克蛋白家族，这些蛋白因在热休克胁迫条件下上调而被称为热休克蛋白或热激蛋白(heat shock protein, Hsp)，但也可能受其他一些胁迫因子(如渗透压、重金属、氧含量和病原物等)诱导而上调[1]。通常根据其分子量大小将这些家族分为Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40和小热休克蛋白sHsp(small Hsp)，它们的立体结构特征、亚细胞定位和功能等各不相同(表1)。Hsp100由六聚体构成，呈三层环状；
Hsp90二聚体在不结合ATP时呈“V”型；
Hsp70不结合ATP时整体上接近串珠状；
多个Hsp60组装成背对背叠加在一起的双层桶状；
Hsp40均含有由4个α螺旋构成的特征性J结构域。不同的sHsp其分子量差异较大，以保守的α-晶状体蛋白结构域为核心，N端和C端各有一段柔性肽链[2]。
表1 主要分子伴侣家族的分布、特征及功能Tab.1 Location, characteristics and function of the major chaperone families
在Hsp分子伴侣网络层次结构中，Hsp70处于上游核心位置[3]。新生多肽链或非天然构象(错误折叠)蛋白作为分子伴侣的底物，通常先在Hsp40的帮助下与Hsp70结合[4]。若Hsp70能帮助底物成功正确折叠，则不需要下游分子伴侣参与，若不成功，则把底物移交给Hsp90和Hsp60等位于下游的作用更为专一的分子伴侣，由其进一步帮助底物完成正确折叠。含J结构域的Hsp40蛋白家族除能加速Hsp70的三磷酸腺苷(ATP)水解速率外，还能往Hsp70传送底物蛋白。一些辅助因子能提高Hsp70的工作效率甚至扩展其底物范围，如核苷酸交换因子(nucleotide exchange factor, NEF)能促进Hsp70中核苷酸的交换[1,5]。
Hsp70在进化上高度保守，广泛存在于原核和真核等生物中，是含量最为丰富的分子伴侣之一，也是唯一已经明确兼具多种活性的分子伴侣[4]。Hsp70具有诸多功能，如帮助新生多肽链的合成与折叠，帮助蛋白易位至内质网等细胞区室，拆解蛋白复合体和调控蛋白活性，以及在真核生物的内吞过程中起关键作用等[7-9]。此外，Hsp70能促进非天然构象蛋白的重折叠，解聚已经形成的蛋白聚集体，协助细胞内的降解系统清除异常蛋白等，Hsp70还是生物体适应热休克等逆境胁迫不可或缺的因子[10-11]。Hsp70这些多样性功能的实现均依赖于其分子水平保守的作用机制，即通过Hsp70分子内各结构域间和结构域内部的构象变化(以下简称“变构”)可逆地调控蛋白底物的结合与解离，并影响底物的构象及解离后去向(如从Hsp70解离后，底物可自发折叠、被移交给其他分子伴侣或被降解等)。可以把Hsp70对不同底物采用相同的机制进行识别、结合及解离这一动态循环过程简称为“变构循环”，相应的作用机制称为“变构机制”(allosteric mechanism)[12-14]。近年来，对Hsp70分子内变构机制的研究有了较大进展。有报道表明，Hsp70与水生动物抗逆/病相关，但其生理过程和分子机制尚不明确。本研究中，重点综述了Hsp70与底物相互作用的分子内变构机制及其与细胞功能的联系，简述了Hsp70参与水生动物抗逆/病的应用研究，分析了研究应用中存在的问题，并提出了未来研究的发展建议，以期为进一步认识Hsp70家族蛋白多功能作用机制及应用提供科学参考。
Hsp70家族成员的氨基酸序列和蛋白结构在不同物种间高度保守[15]，所有Hsp70家族成员均含有两个功能性结构域，一个是位于N末端的核苷酸结合结构域(nucleotide binding domain，NBD)，相对分子质量约为45 000，另一个是靠近C末端的底物结合结构域(substrate binding domain，SBD)，相对分子质量约为25 000。NBD和SBD分别对应Hsp70的ATP酶活性和底物结合活性，两个结构域间由一段较为松散灵活的铰链区连接，Hsp70蛋白的C末端含有无规则区域，其长度在不同Hsp70家族成员中各不相同。位于真核生物细胞质和细胞核的Hsp70，无规则区域通常含有保守的谷氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天门冬氨酸(EEVD)带电荷基序(motif)，能结合特定的辅助因子(如Hsp70-Hsp90 organizing protein，Hop)[16](图1A)。
A、B—Hsp70蛋白的主要结构域示意图；
C—大肠杆菌Hsp70家族蛋白(DnaK)与ADP结合时的“经典”构象(蛋白结构数据库编号2KHO)[21]；
D—DnaK与ATP结合的“经典”构象(蛋白结构数据库编号4B9Q)[22]。其中，NBD用蓝色标出，铰链区用橙色标出，SBDα和SBDβ分别用墨绿色和绿色标出。A，B—schematic representation of the main domains of Hsp70；
C—structures of E.coli Hsp70(DnaK) showing the canonical ADP-bound state (Protein Data Bank ID 2KHO)[21]；
D—structures of DnaK showing the canonical ATP-bound state (Protein Data Bank ID 4B9Q)[22]. NBD, blue; linker, orange; SBDα, dark green; SBDβ, green.图1 Hsp70的结构示意图Fig.1 Schematic representation of structure of Hsp70
NBD结构域由两瓣(lobe)构成，分别为lobeⅠ和lobeⅡ，两瓣间的缝隙底部是核苷酸结合区域。lobeⅠ和lobeⅡ被进一步划分为亚结构域A和B，即ⅠA、ⅠB、ⅡA和ⅡB，这4个亚结构域共同参与核苷酸结合或解离而引起的NBD构象变化(图1A、B)。SBD结构域包含两部分，分别是底物结合结构域β(substrate binding domain β，SBDβ)和底物结合结构域α(SBDα)。SBDβ作为主要的底物结合区域，由2个反向平行的β折叠片和7个环区构成，上层的β折叠片包括β1、β2、β4和β5，下层的β折叠片包括β3、β6、β7和β8，其中，β5、β7和β8被认为是调节SBD内部构象变化的关键因素[17-18]。β1、β2、L1,2和L3,4(L代表环区，L下标的数字代表环区所连接的两个β折叠的编号)构成底物结合区域，包含疏水性的底物结合口袋[17, 19]。SBDα完全由α螺旋组成，包含α螺旋A、B、C、D、E，其中，C、D、E构成一个α螺旋束。SBDα能像“盖子”一样在SBDβ的底物结合区域上打开和关闭。研究表明，SBDα具有较强的动态性，这有利于Hsp70结合不同折叠程度的底物[20](图1B)。
Hsp70的分子内变构机制是其行使功能的基础，Hsp70分子能根据情况改变自身构象。分子内变构使Hsp70具有两种能力，分别为NBD的腺嘌呤核苷酸(ATP或ADP)结合能力和SBD的底物结合能力，这两种能力相互配合，共同完成从识别结合多样性底物到释放底物的变构循环过程，从而行使分子伴侣功能。结合不同核苷酸的NBD，能通过同一个Hsp70分子各结构域内部和不同结构域间的构象变化，调控SBD与底物的结合及解离，SBD与底物的结合及解离又对NBD的构象产生影响，如此各结构域相互协调配合，使Hsp70通过保守的变构机制结合不同底物，从而行使多种多样的细胞功能。在此过程中，有两类协同分子伴侣起到重要作用，分别为Hsp40和NEF。Hsp40家族蛋白均含有特征性的J结构域，这是一种由约70个氨基酸构成的保守的α-螺旋发夹结构域，也是活化Hsp70的ATP酶活性所必需的。Hsp40能识别和捕获底物，将其靶向地转运至处于ATP结合状态的Hsp70，且能显著增强Hsp70的ATP水解活性，帮助Hsp70完成变构循环[23]。不同的Hsp40家族蛋白在序列和结构上存在较大差异，这有利于增强Hsp70的功能多样性[5]。NEF家族蛋白与Hsp70的NBD结构域结合，促进核苷酸交换过程，有利于底物从Hsp70解离，或传递给下游的分子伴侣[24]。
目前，研究者多采用大肠杆菌或酵母的Hsp70家族成员作为模式材料，在体外环境中研究Hsp70的分子内变构机制，特别是大肠杆菌的Hsp70家族蛋白(DnaK)的生化试验结果和其在不同核苷酸结合状态下的高分辨率结构(图1C、D)，为认识Hsp70的变构机制奠定了基础[18]。尽管近期研究表明，来自不同物种Hsp70的变构特性可能存在一定的差异，但Hsp70家族总体的变构循环高度保守[25](图2)。
图2 Hsp70的变构循环示意图Fig.2 Schematic representation of the allosteric cycle of Hsp70
i)结构域未对接(domain undocked)构象。高分辨率蛋白结构信息和生化试验等结果表明，在NBD结合ADP时或无核苷酸结合时，Hsp70的NBD结构域与SBD结构域间无接触，两者由铰链区松散地连接，近似于相互独立的结构域[21]，此时，SBDα覆盖在SBDβ顶部，可以把这种构象简称为结构域未对接构象[6, 14](图2i)。
ii)结构域对接(domain docked)构象。研究表明，ATP结合到Hsp70的NBD后，诱导NBD的lobeⅠ和lobeⅡ发生旋转，铰链区N端的高度保守疏水序列(389VLLL392)与NBD底部的lobeⅡA形成反平行β折叠[22, 26]，这使lobeⅡ的旋转受阻。同时，上述构象变化诱导位于NBD的氨基酸残基Ile168和Asp328分别与位于SBDβ的Asp481和Lys414形成氢键，这使SBDβ锚定在NBD表面。此时，NBD的lobeⅠ和lobeⅡ无法旋转，导致Hsp70的ATP酶活性降低(每6～40 min水解1个ATP分子)[9,19]。变构信号以目前尚不清楚的方式继续传递到SBDα，SBDα的αA和αB融合成一根较长的能与NBD结合的α螺旋结构，SBDα离开SBDβ顶部，暴露出位于SBDβ的底物结合区域，有利于结合底物。可以将Hsp70的这种构象简称为结构域对接构象[6, 14](图2ii)。
iii)从结构域对接转变为结构域未对接。Hsp40帮助底物靶向结合Hsp70，当底物多肽链与Hsp70的SBDβ结合后，SBD通过疏水作用和极性作用改变自身内部构象，SBDβ和SBDα从NBD解离，且SBDα覆盖在SBDβ的顶部，此时Hsp70的底物结合速率常数(约为104/(M·s))及解离速率常数(约为10-3/s)较低，解离平衡常数为0.1～1.0 μM(即对底物高度亲和)，这有利于与底物多肽链紧密结合，防止底物滑脱后发生错误折叠[9,27]。SBD构象的改变也使铰链区离开NBD，NBD的lobeⅠ和lobeⅡ旋转恢复到适合ATP水解的位置，此时ATP酶活性达到最大值(DnaK此时的ATP酶活性比其结构域对接构象下的基础活性约高15 000倍[28])(图2iii)。
iv)从结构域未对接转变为结构域对接。NEF帮助Hsp70进行核苷酸交换，促进底物释放。当ATP结合NBD，此时位于SBDβ下层β折叠片的β8离开β7，而与位于SBDβ上层的β5折叠片通过氢键相连，这使β8由SBDβ的下层重新定位到上层，SBDβ、SBDα和铰链区分别与NBD结合，诱导SBDα离开SBDβ的顶部(图3)。此时底物的结合速率和解离速率分别提高100倍和1 000倍，解离平衡常数提高近10倍(即与底物的亲和性减弱)[9]，有利于底物释放[18]。底物释放后，Hsp70可以在Hsp40的帮助下结合新的底物，重新启动变构循环[21](图2iv)。
A—大肠杆菌Hsp70家族蛋白(DnaK)的SBDβ与ADP结合时的构象(用暗粉色标出，蛋白结构数据库编号2KHO[21]);B—DnaK的SBDβ与ATP结合时的构象(用绿色标出，蛋白结构数据库编号4B9Q[22])。β8用蓝色标出。A—diagrams are drawn for SBDβ from E.coli Hsp70(DnaK)-ADP (dirtypink, Protein Data Bank ID 2KHO[21]); B—diagrams are drawn for SBDβ from DnaK-ATP (green, Protein Data Bank ID 4B9Q[22]).β8 is shown in blue.图3 不同核苷酸结合状态下Hsp70的SBDβ构象比较示意图Fig.3 Schematic comparison of SBDβ conformations of Hsp70 in different nucleotide binding states
另有研究认为，Hsp70的变构过程也会受翻译后修饰的调控，如Thr518位氨基酸的氨酰化(AMPylation)使酵母Hsp70家族成员免疫球蛋白结合蛋白(immunoglobulin binding protein, BiP)的NBD倾向于结合SBD，使BiP失活，限制其结合底物[29]。
3.1 Hsp70的底物特征
Hsp70能结合底物中含有的疏水性短肽基序(motif)，底物范围十分广泛。如大肠杆菌Hsp70蛋白(DnaK)能与约700种底物结合[30-31]，酵母Hsp70蛋白(Ssb2)能结合约80%位于细胞质和细胞核的新生蛋白和约80%的线粒体内新生蛋白，以及大于40%的运往内质网的新生蛋白[7]。Hsp70家族成员的共同特性之一是能通过SBD可逆地结合由5～7个连续的疏水氨基酸(特别是脂肪族氨基酸)形成的短肽基序(如NRLLLTG)，这种基序无严格的序列特异性，两侧常常分布有带正电荷的氨基酸，在蛋白中较常见，平均每30～40个氨基酸残基即出现一次[32]。在天然构象的蛋白中，这类基序通常被包埋在蛋白的疏水核心中。
3.2 Hsp70与多肽底物的结合
Hsp70能结合多肽底物中的疏水短肽基序。在研究Hsp70与底物相互作用的分子机制时，早期的试验中经常采用含有疏水基序的短肽(而不是完整蛋白)作为模式底物，以简化试验条件。第一个解析的Hsp70-底物复合物结构，是来自大肠杆菌Hsp70蛋白(DnaK)的SBD与模式多肽NR(NRLLLTG)形成的复合物。结果显示，多肽NR结合在SBDβ的疏水性区域中，NR的主链被SBDβ环绕，SBDα覆盖在SBDβ疏水性区域的上方，作为“盖子”帮助稳定NR[27]，这与生化试验中推测的结合模式一致。随后，多项NMR和X射线晶体学试验对不同多肽与DnaK形成的复合物进行了结构解析，结果显示，DnaK能以相同的模式结合各不相同的多肽底物[33]，来源于其他生物的Hsp70家族蛋白与底物结合的研究结果也显示相同的结合模式，表明这种结合模式在进化上高度保守[34]。
位于Hsp70的SBDβ底物结合区域由5个底物结合口袋组成，其中，位于中央的口袋被编为“第0位置”(0 th position)，具有最强的底物选择性。如在大肠杆菌Hsp70蛋白(DnaK)的SBD中，中央口袋由6个氨基酸残基构成，即第401位的异亮氨酸、第426位的苯丙氨酸、第436位的缬氨酸、第438位的异亮氨酸、第472位的异亮氨酸和第474位的缬氨酸，这个口袋与底物多肽中的亮氨酸残基(如NRLLLTG的第4位亮氨酸残基L4)最为匹配[27]，但也能结合异亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸。其余的4个底物结合口袋(分别编为-2，-1，1，2位置)可以与多种氨基酸残基结合，这4个口袋的底物结合偏好有轻微不同，整体上都不偏好带负电荷的氨基酸残基[26](图4)。
SBDβ有5个底物结合口袋，其中位于中央的底物结合口袋最具特异性。SBDβ has five binding pockets in which the central binding pocket has the highest specificity.图4 Hsp70的底物结合区域示意图Fig.4 Schematic representation of the region of Hsp70 for substrate binding
尽管Hsp70的SBD在进化上高度保守，但来源于不同生物或不同细胞器的Hsp70在多肽水平上显示出一定的底物偏好性[35]。如位于细胞溶质中的Hsp70更倾向于结合富含脂肪族氨基酸残基的基序，而以BiP为代表的位于内质网的Hsp70更偏好结合富含芳香族残基的基序[36]。另外，相比于原核生物，真核生物Hsp70具有更高的底物结合速率和解离速率[26]。NBD可能对Hsp70的底物特异性也有影响[37]。有学者认为，底物偏好性可能是Hsp70家族成员之间功能差异的原因之一[4]。
3.3 Hsp70与蛋白底物的结合
Hsp70能结合天然蛋白中暴露出的疏水短肽基序。在天然构象蛋白中，包埋在内部的疏水氨基酸短肽基序，在下列情况下暴露出来：1)未折叠蛋白，如新生多肽链或为跨膜转运而解折叠的蛋白，Hsp70能识别结合这类底物中暴露出的疏水性短肽基序[4]；
2)折叠中间体或错误折叠的蛋白底物，如热胁迫条件下变性的蛋白。对这类底物，Hsp70同样能识别结合底物中暴露出的短肽基序，除此之外，似乎还能干扰底物多肽链的长距离相互作用，帮助稳定Hsp70-底物结合位点附近的局部结构，防止底物进一步的错误折叠[38-39]。在Hsp70的作用下，底物结构变得较为稳定，这可能有利于其随后自发重折叠，也可能以此状态为起点，等待Hsp90等其他分子伴侣帮助进一步折叠；
3)天然构象蛋白的主体部分呈正常折叠状态，而在环区或序列末端等未折叠区域存在疏水基序，Hsp70能识别并结合这些暴露出的疏水基序[40]。
Hsp70通过上述变构机制，在细胞水平和整体水平上保护生物体。在细胞水平上，Hsp70一方面行使其作为分子伴侣的持家功能，如促进蛋白底物正常折叠，将底物移交给下游分子伴侣或降解系统，帮助蛋白易位，拆解蛋白复合体及调控蛋白活性等；
另一方面，Hsp70参与细胞对环境胁迫的响应，如清除由胁迫所致错误折叠的蛋白，解聚已经形成的蛋白聚集体等(图5)。在整体水平上，Hsp70参与调控多细胞生物体的免疫及细胞凋亡等过程。Hsp70以上述分子内变构机制为基础，实现其多样性功能，从而帮助细胞和生物体健康地生存[1, 9]。
图5 Hsp70的部分持家功能和胁迫相关功能示意图Fig.5 Some of the diverse housekeeping and stress-related functions of Hsp70
4.1 底物的折叠及跨膜转运
Hsp70在原核生物和真核生物中均能为新生多肽链的折叠提供保护。真核生物还进化出了特定的Hsp70，在蛋白的生物合成中起重要作用[7]。以模式生物酵母为例，Hsp70家族蛋白Ssb、Ssz与Hsp40家族蛋白Zuotin组成核糖体结合复合物，帮助维持核糖体上新生多肽链正确折叠，防止其聚集[41]。
Hsp70还能帮助未折叠多肽链进行跨膜转运。蛋白在跨膜时需要解折叠为多肽链，当多肽链出现在膜的出口侧时，Hsp70分子与其结合，防止多肽链退回入口侧，并为跨膜转运提供所需的拉力，随着多肽链进一步向出口侧跨膜转运，更多的Hsp70结合到多肽链上，防止其过早折叠，并将其转运至下游分子伴侣(如Hsp60)完成折叠。在蛋白转运到线粒体、叶绿体和内质网的过程中均有Hsp70参与[8]。
4.2 底物的移交及活性调控
在细胞中，Hsp70能够将底物移交给Hsp90和Hsp60等其他分子伴侣[1,39]，共同完成底物的折叠。如分子伴侣Hop能结合位于Hsp70和Hsp90的C末端的EEVD基序，以此连接这两个分子伴侣，以及帮助将底物从Hsp70转移至Hsp90，这种从Hsp70到Hsp90的底物转移常见于处于折叠晚期的折叠中间体底物或亚稳态蛋白底物。有研究者认为，沿Hsp70至Hsp90降低的疏水性可能是分子伴侣帮助底物折叠的关键因素之一[42]。
除移交底物外，Hsp70也能通过与Hsp90等其他分子伴侣的合作来调控底物蛋白的活性或稳定性。如糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor，GR)的配体依赖性激活。在生理状态下，Hsp70结合GR的配体结合结构域，使该结构域局部解折叠，这一构象变化妨碍配体糖皮质激素结合GR，或者导致已结合的配体从GR解离，使GR处于失活状态。而Hsp90及其辅助分子伴侣(如Hop、p23)的结合能活化GR，使其从被Hsp70介导的失活状态中释放出来，并有利于配体结合以行使功能[43]。
4.3 底物复合体的拆解
Hsp70能拆解某些天然构象蛋白形成的复合体。如在真核细胞的网格蛋白依赖性内吞中，Hsp70家族蛋白Hsc70参与囊泡的网格蛋白脱包被过程。多个网格蛋白单体能组装成封闭的多面体笼状结构复合体，包被在用于运输“货物”的囊泡表面，当囊泡与目标膜融合时，为完成“货物”的内吞，囊泡的网格蛋白包被需要迅速分解脱落。脱包被过程的关键步骤由Hsp70介导：组成笼状复合体(包被)的网格蛋白C末端含有游离的QLMLT基序，Hsp70在辅助因子的帮助下识别并结合该基序，随即通过变构机制将单个网格蛋白从笼状结构复合体中拆解下来，并逐步分解囊泡包被[44]。
4.4 底物的降解
Hsp70也参与底物的降解。如对那些在一定时间范围内仍未正确折叠或已经完成其生命周期的底物蛋白，需要Hsp70参与将其降解。
Hsp70能通过泛素-蛋白酶体系统(chaperone-assisted ubiquitin-proteasome system, UPS)参与降解底物。UPS是真核生物可溶性蛋白降解的主要途径，其核心是26S蛋白酶体识别被泛素共价修饰的底物蛋白。泛素化的底物蛋白需要解折叠，以多肽链的形式穿过蛋白酶体内部狭窄的中央孔道完成降解。由于存在空间位阻，处于折叠状态的底物无法被降解。Hsp70在UPS通路中的主要功能是将待降解底物稳定在解折叠状态，防止底物在转运至蛋白酶体的过程中重折叠而无法降解[11]。
Hsp70也在其他蛋白降解通路中起作用。与UPS不同，自噬能直接去除蛋白错误折叠形成的不可溶蛋白聚集体。在哺乳动物细胞中，Hsp70家族蛋白Hsc70参与分子伴侣介导的自噬通路，该通路的作用机制尚未完全阐明，而目前已知Hsc70能识别并结合含有KFERQ多肽序列(该序列与Hsp70 SBD识别的底物疏水基序无关)的蛋白，形成的Hsc70-KFERQ蛋白复合物与溶酶体相关膜蛋白2A在溶酶体膜上形成孔道。在Hsp70的帮助下，底物通过孔道易位进入溶酶体被降解[11]。此外，Hsp70家族蛋白还参与其他自噬通路，如分子伴侣辅助的核内体微自噬和分子伴侣辅助的巨自噬，这两种途径的详细机制尚不明确[11]。
4.5 蛋白聚集体的解聚
Hsp70参与细菌、真菌和植物等生物体中的蛋白聚集体解聚过程。这类生物体主要由Hsp100家族蛋白执行解聚功能，而Hsp70能调控Hsp100家族蛋白的活性，即当Hsp70结合Hsp100的中间结构域后，Hsp100才能被活化并完成解聚[45]。处于结构域对接构象的Hsp70对Hsp100家族蛋白存在空间位阻，这使Hsp100只能结合处于结构域未对接构象的Hsp70，从而保证Hsp100选择性地与已结合底物的Hsp70相互作用，防止发生非特异结合[46]。
Hsp70在多细胞动物中执行蛋白聚集体的解聚功能。这类生物体中，在某些Hsp40和NEF家族蛋白的协作下，Hsp70的解聚活性得到大幅增强，进而广谱性地解聚蛋白聚集体[47]。Hsp40能把底物转运至Hsp70，不同的Hsp40识别不同状态的蛋白聚集体，这进一步扩大了Hsp70的底物范围。研究表明，解聚所需的力来源于Hsp70和Hsp40在聚集体表面寡聚化时产生的熵拉力[47]。也有研究认为，NEF家族蛋白Hsp110有助于Hsp70结合蛋白聚集体，或提供了解聚所需的熵拉力[48]。
4.6 Hsp70在整体水平上保护多细胞生物体
Hsp70还通过调控免疫和细胞凋亡等生理过程，在整体水平上保护多细胞生物体，Hsp70的这种调控作用及在人类医学中的应用是当前分子伴侣领域研究的前沿热点之一，并已取得一些进展。
1)一种新型Hsp70抑制剂具有较强的抗肿瘤作用，其靶点位于Hsp70的NBD结构域中第267位半胱氨酸所处的凹槽位置。研究者认为，靶向Hsp70可能会成为治疗急性髓系白血病的新途径，并具有克服癌细胞耐药性的潜力[49]。
2)Hsp70对记忆功能的形成和维持具有重要作用；
在局部缺血和患阿尔兹海默症的模式动物中，提高内源Hsp70合成水平或注射外源Hsp70均有助于减轻病情、刺激神经发生(neurogenesis)及恢复记忆，据此，研究人员考虑把Hsp70作为潜在的治疗药物[50]。
3)人乳头瘤病毒外壳蛋白HPV L1和L2及癌蛋白E7在该病毒的侵染过程中起关键作用，是设计疫苗的靶标抗原，针对此抗原以Hsp70为组成部分的疫苗在模式鼠试验中具有显著的抗癌作用[51]。
水生动物在粮食安全国策中占有不可替代的地位。而水产养殖常常受多种生物和非生物的逆境胁迫因子限制，增强水生动物抗逆/病性能，减少对药物的过度依赖，是减轻限制的可持续发展途径之一。与对Hsp70在人类医学上的应用研究相比，相关学者对Hsp70参与水生动物抗逆/病的研究明显较少，更缺乏对相关生理过程或分子机制的认识。尽管如此，已有一些研究表明，Hsp70与水生动物的抗逆/病之间存在相关性。
5.1 Hsp70与水生动物抗非生物胁迫相关
1)Hsp70基因表达上调有助于水生动物抗离水胁迫。在一项研究中，对凡纳滨对虾Litopenaeusvannamei进行轻度冷激处理，发现处理后的对虾在模拟离水胁迫试验中成活率显著上升。基于进一步的试验结果，研究人员认为冷激处理提高了Hsp70表达，进而抑制细胞色素C、Caspase-3和活性氧自由基等细胞凋亡途径相关分子的作用或活性，从而通过抑制细胞凋亡增强了虾体对离水胁迫的抗性,这有利于活虾离水运输[52]。与此类似，冷激处理能诱导一些贝类体内Hsp70表达上调[53]及斑点叉尾鮰Ictaluruspunctatus脑部Hsp70表达上调[54]。
2)Hsp70基因表达上调有助于水生动物抗重金属胁迫和抗氨胁迫。轻度或非致死热休克(non-lethal heat shock, NLHS)能诱导水生动物Hsp70基因表达上调，进而产生非特异性的保护作用。有研究发现，经NLHS预处理后，凡纳滨对虾幼虾体内Hsp70含量增加，除增强抗高温胁迫能力外，还增强了对致死浓度氨胁迫及中等致死浓度铜、锌胁迫的抗性[55]；
经NLHS预处理的鲤Cyprinuscarpio幼鱼对致死浓度氨胁迫的抗性提高了2～3倍[56]；
经NLHS预处理的卤虫Artemiafranciscana，显著地提高了对急性锌和镉胁迫的抗性[57]；
经NLHS预处理的贻贝Mytilusedulis，显著提高了对镉胁迫的抗性[58]。
5.2 Hsp70与水生动物抗生物胁迫相关
1)诱导增加水生动物内源的Hsp70含量，能增强其抗生物胁迫能力。有研究表明，经NLHS诱导增加Hsp70含量，增强了凡纳滨对虾对副溶血弧菌感染的抗性，并发现敲低Hsp70的对虾在副溶血弧菌和白斑综合征病毒感染时死亡率升高。研究者认为，Hsp70能激活凡纳滨对虾的免疫系统，从而起到了增强其抗生物胁迫的作用[59-60]。与此类似，经NLHS诱导增加卤虫幼虫Hsp70含量，增强了卤虫对坎氏弧菌和副溶血弧菌感染的抗性[61-62]，而敲低Hsp70的卤虫幼虫在弧菌攻毒试验中的生存率降低了约30%[63]。除NLHS外，间苯三酚(一种来自植物的多酚化合物)能诱导增加卤虫和罗氏沼虾Macrobrachiumrosenbergii体内Hsp70含量，并增强它们对细菌的抗感染能力[64-65]；
香芹酚也能诱导卤虫Hsp70的表达，从而增强其对哈维氏弧菌的抗感染能力[66]。
2)通过注射和饲喂等外源途径给予Hsp70，能增强水生动物抗生物胁迫能力。如注射重组表达Hsp70的凡纳滨对虾，在副溶血弧菌攻毒试验中存活率提高了75%，并检测到IKKβ、Crustin等多种免疫相关基因被诱导表达，这暗示Hsp70可能是通过参与调控免疫过程起到抗感染作用[67-68]。注射Hsp70还增强了对虾对白斑综合征病毒的耐受性[68]。与此类似，把重组表达的大肠杆菌Hsp70蛋白(DnaK)注射到斑节对虾后，再注射哈维氏弧菌，发现对虾死亡率降低，并观察到免疫相关蛋白酚氧化酶原的表达显著提高[69]。
饲喂Hsp70也能增强水生动物抗生物胁迫能力。如Sung等制备出能生产卤虫Hsp70或大肠杆菌Hsp70蛋白(DnaK)的大肠杆菌制剂，在弧菌攻毒试验中，给卤虫喂食这种制剂能提高卤虫存活率，研究人员推测，这是由于Hsp70提高了酚氧化酶等免疫相关蛋白的活性，并提高了卤虫的免疫力，从而提高了其存活率[70]。
综上可见，通过诱导水生动物产生内源Hsp70或给予外源Hsp70，均有助于增强水生动物的抗逆/病性。除以上例子外，在过去5年内，国内外还有120多篇相关研究报道，表明Hsp70在不同程度上与水生动物及其他农业动植物抗逆/病相关联，所涉及的胁迫因子包括高温、低温、干旱、重金属、低氧、氨、盐、酸、细菌、病毒和真菌等。所涉及的水生动物还包括草鱼、鲫、半滑舌鳎、卵形鲳鲹、红鳍东方鲀、短须裂腹鱼、远海梭子蟹、拟穴青蟹、菲律宾蛤仔、栉孔扇贝、马氏珠母贝、糙海参和可口革囊星虫等；
畜禽动物包括牛、鸡、猪、羊、驴、鸭、鹿和牦牛等，已有应用Hsp70基因单核苷酸多态性作为DNA标记促进牛和鸡抗逆/病育种的报道；
农作物包括玉米、水稻、小麦、棉花、大豆、番茄和辣椒等，已有通过诱导Hsp70基因表达增强玉米和棉花抗旱性的报道。由此认为，Hsp70在包括水生动物在内的农业动植物抗逆和病害防控方面可能具有广泛的潜在应用价值。
6.1 Hsp70变构机制及其应用研究中存在的问题
近年来，对Hsp70变构机制和功能的认识取得了较大进展，且已有研究证明Hsp70参与了水生动物抗逆/病等生理过程，但研究中仍存在以下几方面的问题。
1)Hsp70在生物体内的原位变构机制尚未完全阐明。在研究Hsp70的变构机制时，为了减少变量，多采用模式底物在体外环境中进行。而在体内原位条件下，蛋白常常受到多种翻译后修饰的调控，Hsp70所处的细胞内环境高度复杂并时刻处于动态变化中，这些变量在体外试验中被排除在外。因此，体外试验中得到的研究结果，不能完全代表Hsp70在体内的原位变构机制，仍需进一步研究。
2)多细胞生物Hsp70的分子内变构机制详情尚不清楚。尽管Hsp70家族蛋白高度保守，但从单细胞生物向多细胞生物的进化过程中，为了适应更为复杂的细胞内外环境，多细胞生物分化产生了更为特异的细胞功能及相应的生理过程，作为这些过程的参与者，Hsp70一方面表现为高度保守，另一方面，不同物种的Hsp70基因在进化过程中发生了多态性变异，所编码的Hsp70家族蛋白在氨基酸组成、亚细胞定位和底物偏好性等方面产生了差异，这些差异对不同Hsp70的分子内变构机制的动态性和复杂性的影响程度尚不明确，对其功能多样性的影响也不确定。
3)Hsp70参与水生动物抗逆/病的生理过程和响应机制尚未被揭示。近年来，关于Hsp70家族蛋白在模式生物和人类的细胞周期调控、细胞凋亡、免疫调节、抗生物胁迫和抗非生物胁迫等多种生理(抗逆)过程中的机制已取得一定进展。但对于包括水生动物在内的农业动植物，Hsp70所介导或参与的主要细胞分子通路及调控网络等生理或抗胁迫应答机制尚不明确。在水生动物、畜禽动物、农作物中，有关Hsp70的研究大多数集中于基因测序，检测Hsp70基因在不同条件下的表达水平差异，以及Hsp70基因过表达或被敲低(除)后的性状变化，尚限于相关性结果，极少见有关Hsp70参与水生动物抗逆/病生理过程的报道。缺乏对生理或抗逆过程的完整通路及分子机制的认识，限制了对Hsp70的应用。
6.2 未来重点研究方向
针对分子伴侣Hsp70变构机制及其应用研究中存在的问题，今后可从以下方面开展相关工作。
1)加强对Hsp70在原位环境中变构机制的研究。采用高灵敏度或高分辨率技术，如冷冻电子断层成像术、单分子荧光共振能量转移和核磁共振等，以天然蛋白为底物，研究Hsp70在细胞原位环境中的精准变构机制。
2)深入开展水生动物Hsp70变构机制的研究。目前，已报道了多种水生动物的Hsp70基因序列信息，在此基础上，首先选取一些主要养殖物种，并结合结构生物学、分子生物学和分子遗传学等技术，研究其Hsp70蛋白结构及变构机制，这不仅有助于加深和扩展对Hsp70整体变构景观和进化特点的认识，也有利于更好地应用Hsp70。
3)开展Hsp70参与水生动物抗逆/病的分子通路和作用机制研究。解析不同生理、逆境条件下，水生动物主要养殖物种的Hsp70与上下游分子的互作机制和调控方式，进而掌握这些动物中Hsp70对不同生理、胁迫条件的响应规律，为应用Hsp70提供理论依据。
4)拓展Hsp70在水生动物应用方面的研究。Hsp70在未来可以应用于水生动物的多个方面，首先可能会在以下几方面获得突破：一是育种方面，筛选Hsp70基因单核苷酸多态性DNA标记应用于水生动物抗逆/病育种，以降低育种成本及加快育种速度；
二是免疫强化方面，在掌握Hsp70对于水生动物免疫活性调节规律的基础上，一方面拓展试验对象，探索联用已有的益生菌等免疫强化剂共同制备饲料或投入品，在养殖过程中增强水生动物抗逆/病能力，特别是非特异性免疫抗逆/病性，从而减轻水产养殖过程中疾病的发生，另一方面，Hsp70或可作为抗原载体，强化与之配合使用的抗原免疫原性，有利于提高相关疫苗的免疫效果；
三是发挥其抑制细胞凋亡的功能，Hsp70具有应用于水生动物保鲜及运输过程中的潜力，从而减少药品或投入品的使用，有利于食品安全；
四是Hsp70可以作为药物靶点应用于抗某些病原微生物感染的药物开发。
综上所述，Hsp70的变构机制特性及其诸多功能特点，使其具有较大的潜在应用空间和优势，其单核苷酸多态性可作为分子标记用于促进抗逆/病育种，并具有作为抗逆/病诱导剂、免疫强化剂或疫苗组分的应用潜力，这将有利于减轻对抗生素等药物的依赖，以及减轻抗药性等不良影响，有助于提高水产养殖过程中水生动物的产量并改进质量。
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