梁思怡，纪胜男，田璐肖，智静驿，李丽丽，哈婧
(1.河北科技大学 化学与制药工程学院，河北 石家庄 050018；
2.河北御芝林药业有限公司，河北 邢台 054400)
艾叶(Artemisiaargyi)为菊科多年生草本植物，又名冰台、炙草等[1].夏季花未开时采摘其干燥叶，可全草入药，味辛、苦，对慢性支气管炎、肺气肿、肝炎、哮喘等疾病都有疗效[2-4].艾叶主要含有挥发油、酚类、鞣质、苯丙素类等活性物质[5-6]，具有抗真菌、细菌、病毒感染、各种炎症等作用[7-8].中药配方颗粒，是将单味中药饮片经提取、浓缩、干燥、制粒、包装等过程制成的纯中药产品，是传统中药的一种新的用药形式[9-10]，有方便携带、无需煎煮、便于医生调剂等优点[11-13].配方颗粒在制备过程中以“标准汤剂”为参照物，制备过程中经高温煎煮后，挥发油成分会随水蒸气蒸馏，导致挥发油为主要成分的药物有效成分散失[14].β-CD是由淀粉在微生物酶作用下产生的环状低聚糖，在现代的制剂生产中一般使用β-CD与挥发油制成包合物[15-16].邹新成[17]通过对挥发油的包合率、收得率及综合评分进行考查，用气相色谱仪对制得的包合物进行含量测定，以桉油精和龙脑的总含量计算，3批包合物的包合率分别为81.99%、76.11%、87.14%.周瑶、沈德凤等[18-19]提出饱和水溶液包合法，操作简单，但容易受人为和仪器等不可控因素的影响造成实验差异.本实验通过优化挥发油与β-CD包合工艺，得到最佳包合条件，在此条件下进行配方工艺制备，大大提高了制备艾叶配方颗粒过程中指标成分的转移率，增加了药物的稳定性[20-21]，为指导企业实际生产提供一定科学依据.
1.1 药品与试剂
艾叶饮片(批号20201211，河南，乐仁堂大药房提供)；
桉油精(PS020020，中国食品药品检定研究院)；
龙脑(PS2103326，中国食品药品检定研究院)；
乙酸乙酯、无水乙醇、正己烷(均为分析纯，天津市永大化学试剂有限公司)；
β-环糊精(天津市大茂化学试剂厂)；
纯净水(石家庄山中纯净水有限公司).
1.2 实验仪器
电子天平(AL204，梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；
SQP十万分之一电子天平(德国赛多利斯科学仪器有限公司)；
98-1-B型电子调温电热套(天津市泰斯特仪器有限公司)；
RE-52B旋转蒸发器(上海青浦沪西仪器厂)；
DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器；
SP SCIENTIFIC冷冻干燥机；
GC Smart(GC-2018)气相色谱仪；
HT-1色谱柱(上海星铱色谱科技).
2.1 饮片含量测定方法
以2020版《中国药典》[22]为依据，按照气相色谱法通则(0521)测定.取艾叶饮片2.5 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加水300 mL，连接挥发油测定器，自测定器上端加水使充满刻度部分，并溢流入烧瓶为止，再加乙酸乙酯2.5 mL，连接回流冷凝管.加热至沸腾5 h，放冷，分取乙酸乙酯，置10 mL量瓶中，用乙酸乙酯分次洗涤测定器及冷凝管，转入同一量瓶中，用乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，即得.精密吸取供试品溶液1 μL，注入气相色谱仪，进行含量测定，气相色谱条件见表1，测定结果见表2.
表1 含量测定程序升温Tab.1 Content determination by temperature programming
表2 饮片含量测定结果Tab.2 Determination results of decoction pieces
2.2 挥发油提取
2.2.1 饮片粉碎对挥发油提取的影响
取同一批药材4份，每份60 g，2份粉碎，2份不粉碎，每份加10倍量水，浸泡1 h，加热回流4.5 h，读取挥发油量，结果见表3.
表3 饮片粉碎对挥发油提取的影响Tab.3 Effect of decoction pieces crushing on extraction of volatile oil
未粉碎饮片出油量较高，可能是由于艾叶粉碎后碎片过多，挥发油不能够完全外逸，因此在后续挥发油提取中对艾叶饮片不进行粉碎工艺.
通过对加水量、浸泡时间、提取时间进行3因素3水平的正交实验，提取挥发油的最佳工艺为艾叶饮片100 g，不粉碎，12倍水浸泡1.5 h，按2020版《中国药典》第四部项下通则(2204)挥发油测定法安装冷凝回流装置，冷凝回流5 h，静置1 h后收集提取的挥发油，放入冰箱冷藏24 h后用于包合.
2.2.2 挥发油空白回收实验
挥发油具有不稳定性，加热条件下易随水蒸气蒸馏，在加热回流提取挥发油的过程中，导致挥发油有损失，为消除包合率计算误差，故对挥发油进行空白回收实验.
精密量取艾叶挥发油1 mL，至圆底烧瓶中，加300 mL水，回流提取5 h，静置1 h后读取回收的挥发油体积，平行3组实验，结果见表4.
表4 挥发油空白回收率(n=3)Tab.4 Blank recovery of volatile oil(n=3)
挥发油空白回收率[23]公式为
(1)
2.3 挥发油包合工艺
参考文献[17-19,24]的挥发油包合工艺，初定工艺为V(挥发油)∶V(β-CD)∶V(水)=1∶8∶10，V(挥发油)∶V(乙醇)=1∶1，包合温度60 ℃，包合时间2 h，平行测定3次，所得包合率分别为81.99%、76.11%、87.14%，包合率较低，在此条件下对包合工艺进行优化.
通过对包合温度、包合时间、挥发油与水和β-CD的比例进行考查，以包合率作考查指标，结果得最佳包合工艺为V(挥发油)∶V(β-CD)∶V(水)=1∶10∶12，将适量β-CD与水置于圆底烧瓶中，65 ℃下恒温搅拌1 h，缓慢滴加挥发油与无水乙醇体积比1∶2混合的稀释液，约10 s 1滴，继续恒温磁力搅拌1 h，放冷，得挥发油包合物水溶液，冰箱预冻，冷冻干燥即得.冷冻干燥参数见表5.
表5 冷冻干燥参数Tab.5 Freeze drying parameters
2.4 包合率的测定
挥发油供试品的制备：取0.5 mL挥发油，精密称定，置500 mL圆底烧瓶中，加入300 mL水，按照2.1项下供试品制备方法冷凝回流提取，静置1 h后将乙酸乙酯层转入10 mL容量瓶中，稀释至刻度.
对照品溶液制备：取桉油精和龙脑适量溶于乙酸乙酯，制成含桉油精0.2 mg/mL，龙脑0.1 mg/mL的混合对照溶液.
包合物供试品的制备：称取包合物适量，精密称定，按照2.1项下方法提取供试品溶液，精密吸取供试品溶液1 μL，注入气相色谱仪，进行含量测定，共测试5组包合物.结果见表6.
表6 包合率测定结果(n=5)Tab.6 Result of inclusion rate determination(n=5)
(2)
优化后的包合工艺所制得包合物的包合率有明显提高，通过平行实验可知该包合工艺稳定可行，可用于后续配方颗粒制备过程中挥发油的包合.
2.5 艾叶“标准汤剂”制备工艺优化
取未进行包合工艺制备的艾叶“标准汤剂”2.5 g，按《中国药典》艾叶项下含量测定提取供试品，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入正己烷25 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用正己烷补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得.精密吸取供试品溶液1 μL，注入气相色谱仪，未检出指标成分，结果见图1.
图1 艾叶“标准汤剂”含量测定色谱Fig.1 Chromatogram of artemisia argyi “standard decoction” for content determination
优化后的制备工艺为：取艾叶饮片100 g，12倍量水浸泡1.5 h，安装冷凝回流装置提取挥发油，将提取的挥发油制成包合物.药液过滤放冷待用，药渣煎煮2次，第1煎加12倍量水，煮沸后煎煮30 min，300目(孔径48 μm)滤布趁热滤过；
第2煎加10倍量水，煮沸后煎煮20 min，300目(孔径48 μm)滤布趁热滤过，3次滤液合并，减压浓缩(温度60 ℃)至约1∶2(投料量∶浸膏体积=1 g∶2 mL)的浸膏，喷雾干燥，将包合物与干燥粉混合，即得.
取标准汤剂0.7 g，精密称定，按2.1项下供试品制备方法制备标准汤剂供试品，精密吸取对照品溶液与供试品溶液1 μL，注入气相色谱仪，进行含量测定，并计算桉油精及龙脑的转移率.结果见表7.
表7 “标准汤剂”含量测定结果Tab.7 Determination results of “standard decoction”
(3)
由数据可知，桉油精、龙脑的平均转移率为33.71%、29.61%，按均值的30%上下浮动，得桉油精转移率为23.60%～43.82%，龙脑的转移率为20.73%～38.49%.
2.6 艾叶“标准汤剂”指纹图谱
为了考查从艾叶“标准汤剂”到配方颗粒制备过程中化学成分的变化，加强专属性鉴别，进行色谱条件优化，并建立“标准汤剂”指纹图谱对其进行评价.将12批艾叶“标准汤剂”色谱图导入到“中药色谱指纹图谱相似度评价系统中”，选出10个共有峰，并将桉油精色谱峰定为参照峰.指纹图谱气相条件见表8，“标准汤剂”特征图谱见图2，叠加图谱见图3.
表8 指纹图谱程序升温Tab.8 Temperature programming of fingerprint
图2 艾叶“标准汤剂”特征图谱Fig.2 Characteristic spectrum of Artemisia argyi “standard decoction”
图3 12批艾叶“标准汤剂”叠加图谱Fig.3 12 Batches of artemisiae argyi “standard decoction” overlay mapping
2.7 艾叶配方颗粒制备工艺
取艾叶饮片100 g，12倍量水浸泡1.5 h，安装冷凝回流装置提取挥发油，将提取的挥发油制成包合物.药液过滤放冷待用，药渣煎煮2次，12倍水，每次1 h，300目(孔径48 μm)滤布趁热滤过，3次滤液合并，减压浓缩(温度60 ℃)至约1∶2(投料量(1 g)∶浸膏体积(2 mL))的浸膏，喷雾干燥，将制得的包合物与干燥粉、适量辅料混合制粒，即得.
取配方颗粒0.7 g，精密称定，按照2.1项下供试品制备方法制备配方颗粒供试品，精密吸取对照品溶液与供试品溶液1 μL，注入气相色谱仪，进行含量测定，结果见表9.
表9 配方颗粒含量测定结果Tab.9 Determination results of formula granule
2.8 饮片、标准汤剂、配方颗粒中指标成分的相关性
2.8.1 指标成分转移率数据
将艾叶饮片、“标准汤剂”和配方颗粒含量测定结果及出膏率进行汇总，比较桉油精和龙脑在三者间的传递情况.具体见表10，由汇总结果可知，桉油精和龙脑在“标准汤剂”和配方颗粒中的转移率相近.
表10 指标成分转移率结果Tab.10 Index component tromsfer results
标准汤剂中桉油精的平均转移率为33.71%，龙脑的平均转移率为29.61%.配方颗粒中桉油精的平均转移率为33.48%，龙脑的平均转移率为25.41%，实验数据表明此方法制得的配方颗粒和标准汤剂成分含量并无显著差异.
2.8.2 配方颗粒与“标准汤剂”特征图谱对比
称量12批艾叶配方颗粒，按2.1项下供试品制备过程，配制样品溶液；
根据指纹图谱检测条件测定，记录色谱图.以艾叶“标准汤剂”的色谱图为对照图谱，将每批配方颗粒的特征图谱与对照图谱进行相似度比较.由结果可知，配方颗粒与“标准汤剂”具有较高的相似性，且艾叶配方颗粒的化学成分与“标准汤剂”基本一致，结果见表11、图4.
表11 相似度评价结果Tab.11 Similarity evaluation results
图4 配方颗粒与“标准汤剂”、饮片特征图谱对比Fig.4 Comparison of characteristic spectrum between formula granule and “standard decoction” and decoction pieces
艾叶的主要活性成分是挥发油类，包括醚类、醇类、半萜类、芳香族化合物等化学结构[25].其中桉油精、龙脑在挥发油类中占比较大，桉油精具有抗炎、抗菌等作用，龙脑也具有一定的抗菌和镇痛作用[26-28].2020版《中国药典》以2种化合物为艾叶的质量控制成分，要求饮片中桉油精含量不得低于0.05%，龙脑含量不得低于0.02%.将饮片直接进行水提工艺，在标准汤剂中并未检测到桉油精和龙脑，说明挥发油类在饮片煎煮过程中大多流失.进行挥发油提取包合后，在标准汤剂的含量测定中，桉油精和龙脑的平均含量分别为0.738 4、0.334 1 mg/g，减少了有效成分的挥发损失.
根据传统中药煎煮操作规范对艾叶饮片及其标准汤剂进行含量测定，发现艾叶饮片含量测定合格，但在标准汤剂中未检测出桉油精及龙脑.二者都属于挥发油类，具有不稳定性，为保证有效成分的转移，在煎煮艾叶标准汤剂时，需将挥发油类成分进行提取，与β-CD形成包合物后再与喷雾干燥粉混合制成配方颗粒.水溶液饱和法相较于其他包合方法操作简单，包合率高，且适用于大生产，利用本实验优化后的包合工艺对艾叶挥发油进行包合，测得的平均包合率为96.40%，配方颗粒中桉油精和龙脑的平均转移率为33.48%，25.41%.数据表明利用该工艺有效减少了挥发油类成分在煎煮过程中的流失，工艺稳定可行，为艾叶配方颗粒的工业化生产提供理论参考.在本实验挥发油的提取工艺中，浸泡时间和提取时间相对较长，延长了含量测定和配方颗粒制备的前期工作，后续将对此部分进行深一步的考查优化.
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