李昕宇，马金璞，2，张玉璇，2，郭星晨，2，杨具田，2，徐红伟，2，曹忻，2，高丹丹，2*
（1．西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730124；
2．西北民族大学生物医学研究中心，甘肃兰州 730030）
我国每年羊宰杀量高达170万头，羊血产量达510 t。多数屠宰企业的羊血作为屠宰废弃物直接排放，不仅造成资源浪费，还会污染环境。羊血固体成分中，蛋白质含量约18%[1]，主要由血清蛋白和球蛋白组成[2]，其中血清蛋白占总蛋白的比例较大。血清蛋白含有人体必需的8种氨基酸，进入人体后被消化酶分解成稳定的多肽。羊血多肽具有降血压、抗氧化、抗菌和增强免疫力等功能[3]，在食品、保健品、药品和化妆品方面具有广阔的应用前景。
利用动物血液研发功能性成分已成为研究热点。如高丹丹等[4]采用中性蛋白酶水解藏羊血清蛋白得到抗氧化肽；
汤海霞[5]采用蛋白酶水解绵羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽；
胡凤姣[6]采用木瓜蛋白酶水解鸡血分离出抗菌肽。采用酶解法水解动物血液制备生物活性肽成为最常用的方法，具有价格低廉、易转化等优点。羊血营养价值丰富，但目前对水解羊血清蛋白的研究相对较少，特别是利用碱性蛋白酶法水解羊血清蛋白制备生物活性肽的研究鲜见报道。本研究采用碱性蛋白酶水解羊血清蛋白，通过测定酶解温度、水解时间、水解pH值和加酶量对羊血清蛋白水解度的影响，在单因素的基础上用响应面分析试验法优化酶解工艺，研究结果为羊血资源和羊血清副产品的开发和利用提供参考。
1.1 样品采集
新鲜羊血采集自甘肃省甘南自治州夏河县（地理坐标为：35°12"N，东经102°31"E）。
1.2 试验试剂
碱性蛋白酶（酶活力100 000 U/g，中生瑞泰科技有限公司）、福林酚（上海中泰化学试剂有限公司）；
碳酸钠溶、三氯乙酸；
正丁醇、正丙醇、乙二醇、乙醇等均为分析纯。
1.3 试验仪器
721型紫外分光光度计（惠普有限公司）、TGL-16M高速台式冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）、JA2003N电子天平（上海精密科学仪器有限公司）、HWS28型电热恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司）、PB-10型精密pH计（Sartorius公司）。
1.4 试验方法
1.4.1 羊血清蛋白酶解液的制备
新鲜羊血加1.5% C6H5O7Na3抗凝，4 000 r/min离心20 min取上清液[7]，脱盐、超滤浓缩，得到羊血清蛋白。调节pH值，加入碱性蛋白酶，100℃水浴加热15 min，冷却至25℃。加2 mL 0.4 mol/L三 氯 乙 酸，8 000 r/min离心15 min取上清液，冷冻干燥，获得羊血清蛋白酶解粉。
1.4.2 羊血清蛋白水解度（DH）的测定
DH的测定采用茚三酮比色法[8]，本试验以甘氨酸为标品做标准曲线，以甘氨酸含量（mg）为x轴，吸光值为y轴绘制标准曲线，曲线的回归方程为y=5.976 8x-0.2149（R²=0.994 5）。配制100 mg/L的羊血清蛋白酶解液，吸取2.0 mL于25 mL比色管中，加入1 mL的1.2%的茚三酮显色剂和0.1 mL 1%的抗坏血酸溶液，沸水中加热15 min取出，冷却至室温后，加蒸馏水定容到刻度线，采用721型可见分光光度计在570 nm处测OD值，计算DH。
式中：A2为不同时间内酶解液中的总游离-NH2数；
A1为羊血清蛋白水解后的总游离-NH2数；
A0为羊血清蛋白中自身固有的游离-NH2数。
1.4.3 酶解条件的单因素试验设计
配制100 mg/L的羊血清蛋白酶解液于25 mL比色管中，固定羊血清蛋白底物浓度为5%，改变酶解温度（35、40、45、50、55、60、65℃）、反应时间（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5 h）、pH值（8、9、10、11、12、13、14）和加酶量（1 000、1 500、2 000、2 500、3 000、3 500、4 000 U/g）4个因素条件，考察各因素对羊血清蛋白的水解效果的影响，每个因素做3次平行试验，取平均值。
1.4.4 试验设计与响应面分析
根据单因素试验结果，以酶解温度（A）、水解时间（B）、pH值（C）和加酶量（D）等4个因素为自变量，以羊血清蛋白的DH（Y）为响应值，设计4因素3水平响应面试验[9-10]。试验因素与水平设计见表1。
表1 试验因素与水平设计Tab.1 Experimental factors and horizontal design
1.5 数据统计与分析
试验数据采用Origin 8.5软件进行单因素试验作图，SPSS 25软件进行因素间显著性分析，Design-Expert 8.0.6软件进行响应面法方差试验分析[11]。P＜0.05表示影响显著，P＜0.01表示影响极显著。
2.1 单因素试验分析
2.1.1 酶解温度对DH的影响（见图1）
由图1可知，在试验测定的温度范围内，DH随着酶解温度增加呈先增大后降低的趋势，酶解温度为50℃时，羊血清蛋白质DH达最高；
35～50℃时，DH随着酶解温度升高而逐渐升高；
50～65℃时，DH逐渐降低。
图1 酶解温度对DH的影响Fig.1 Effect of enzymolysis temperature on DH
结果表明，温度过高或过低均可影响酶的活性，进而影响羊血清蛋白DH。因此，选取50℃为最佳酶解温度。
2.1.2 水解时间对DH的影响（见图2）
图2 水解时间对DH的影响Fig.2 Effect of hydrolysis time on DH
由图2可知，在测定范围内，羊血清蛋白的DH随着水解时间的增大逐渐升高，水解时间到5 h后，DH上升速率减慢趋于平缓。
其原因是底物羊血清蛋白随着水解时间不断减少，而酶解产物的逐步积累也会对碱性蛋白酶和底物之间形成隔断[12]，从而产生一定的抑制作用。因此，选择碱性蛋白酶水解羊血清蛋白的最适时间是5 h。
2.1.3 pH值对DH的影响（见图3）
从图3可知，在试验测定范围内，pH值为8～11时，DH逐渐升高，pH值为11～12时，DH缓慢下降，之后pH值越大，DH下降越快；
pH值为11时，羊血清蛋白的DH最高。
图3 pH值对DH的影响Fig.3 Effect of pH on DH
pH值通过影响碱性蛋白酶分子活性部位上相关基团解离程度[13]，进而影响酶的作用，在最适pH时，酶分子上活性基团的解离状态与底物结合最佳，pH值高于或低于最适pH时，酶活性基团解离程度降低，影响酶和底物的结合能力及酶的反应速率。因此，确定碱性蛋白酶水解羊血清蛋白的最适pH值为11。
2.1.4 酶添加量对DH的影响（见图4）
图4 加酶量对DH的影响Fig.4 Effect of enzyme addition on DH
从图4可知，加酶量为1 000～2 500 U/g底物时，DH随着加酶量的增加而明显增大。当加酶量3 000 U/g时，DH上升速度已非常缓慢，继续添加酶，DH变化程度小。
实际生产中，考虑经济成本[14]应该尽量减少加酶量，故确定碱性蛋白酶水解羊血清蛋白的最适加酶量为3 000 U/g底物。
2.2 响应面试验结果分析
2.2.1 多元二次模型方程的建立及检验（见表2、表3）
通过单因素试验结果，探究各因素相互作用时对羊血清蛋白DH的影响，固定底物浓度为5%，以羊血清蛋白的DH为响应值，采用响应曲面分析法[15]对碱性蛋白酶水解羊血清蛋白工艺进行4因素3水平优化试验设计[16]，试验方案及结果见表2。
表2 Design-Expert试验设计方案及结果Tab.2 Design-Expert experimental design and results
对表2的数据进行多元回归分析，以酶解温度、pH值、水解时间和加酶量为因素进行拟合回归分析，获得二次回归方程。
DH=-403.64+5.41A+34.44C+26.74B+0.04D+0.11AC-0.06AB-2.19AD+0.21CB-1.34CD-4.17BD-0.05A2-3.73C2-1.06B2-2.99D2，方差分析结果见表3。
表3 响应曲面方差分析Tab.3 Response surface analysis of variance
本试验过程中设计的模型总体表现极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05）[10]，R2与R2Adj差值小，说明响应面的优化程度好[17]；
并且R²值较大，说明试验具有较好重复性。变异系数为0.71%，说明该模型拟合程度较好，试验误差小，采用该模型对碱性蛋白酶水解羊血清蛋白的水解过程进行优化合适。由F值得出，影响羊血清蛋白的DH的主次顺序为D＞A＞C＞B。
2.2.2 响应面分析与优化（见图5～图10）
由图5～图10可知，各响应面随着各个因素增大，羊血清蛋白的DH均呈现先升后降的趋势，羊血清蛋白的DH存在最大值；
通过分析各因素之间相互作用对DH的影响，确定碱性蛋白酶水解羊血清蛋白的最佳范围。
图5 酶解温度和水解时间对DH的影响Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis temperature and hydrolysis time on DH
图10 pH值和加酶量对DH的影响Fig.11 Effect of pH value and amount of enzyme added on DH
AB交互作用时，酶解温度曲面陡峭幅度变化程度高于pH值且呈椭圆状密集，表明酶解温度比pH值的影响更显著；
AC交互作用时，酶解温度曲面陡峭呈椭圆形，且幅度变化程度高于水解时间，表明酶解温度比水解时间的影响更显著；
AD交互作用时，碱性蛋白酶添加量曲面呈椭圆状，且陡峭幅度显著高于酶解温度，表明加酶量比酶解温度的影响更为显著；
BD交互作用时，加酶量曲面陡峭密集，且幅度变化程度高于pH值，表明加酶量比pH值的影响更显著；
BC交互作用时，pH值曲面陡峭幅度变化程度高于水解时间，虽呈圆状但较为密集，表明pH值比水解时间的影响更显著。因此，4个因素对羊血清蛋白的DH的影响关系为D＞A＞C＞B，与表3中交互项F值分析结果一致。
图6 酶解温度和pH值对DH的影响Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis temperature and pH value on DH
图7 酶解温度和加酶量对DH的影响Fig.7 Effect of enzymolysis temperature and enzyme amount on DH
2.3 模型验证试验
由响应面分析试验结果和多项回归方程，得出羊血清蛋白的DH最高时各因素条件分别为温度51.2℃、水解pH值11.59、水解时间5.10 h、酶添加量为3 155 U/g。在此条件下，羊血清蛋白的DH预测值为26.92%。在最优的水解条件下做3组平行试验，羊血清蛋白DH分别为27.05%、26.90%和26.97%，其平均值为26.97%，预测结果与实际结果的相对误差仅有0.19%。因此，得出的试验模型能准确地预测羊血清蛋白的DH值。但考虑到实际操作情况，对羊血清蛋白质碱性蛋白酶水解条件修正为反应温度51℃、pH值11.6，反应时间5.1 h和酶添加量3 200 U/g，羊血清蛋白的DH预测值为26.89%。
图8 水解时间和pH值对DH的影响Fig.8 Effect of hydrolysis time and pH value on DH
图9 水解时间和加酶量对DH的影响Fig.9 Effect of hydrolysis time and amount of enzyme on DH
本研究由单因素结果可知，在酶解温度50℃、水解时间5 h、pH值11和碱性蛋白酶加量3 000 U/g时，羊血清蛋白的DH值达到最大。在此试验基础上使用响应面试验法，以羊血清蛋白的DH值为响应值，确定碱性蛋白酶水解羊血清蛋白最优条件为：水解时间5.1 h、反应温度51℃、pH值11.6和加酶量3 200 U/g；
在此条件下，羊血清蛋白的DH可达26.89%。由方差分析结果可知，pH值和水解时间、pH值和加酶量、水解时间和加酶量的两两交互作用对羊血清蛋白DH影响较显著；
酶解温度和水解时间、酶解温度和pH值的两两交互作用对羊血清蛋白DH影响不显著。