张健苗，林添春，廖振瑜，杜宇坤，余仲昊，刘景建，伍赛群，康晓东，徐曲毅，石河，赵建，刘超，谷党恩
1.广州市公安局花都区分局，广东 广州 510800；
2.南方医科大学法医学院，广东 广州 510515；
3.昆明医科大学法医学院，云南 昆明 650500；
4.广东省公安厅，广东 广州 510030；
5.广州市刑事科学技术研究所 法医病理学公安部重点实验室，广东 广州 510442
水中尸体的死因鉴定是法医工作的重点和难点。在溺死过程中，硅藻等浮游生物会随溺液吸入死者的肺内，其中一部分硅藻穿透肺泡-毛细血管屏障进入肺血管，并通过体循环到达肝、肾、骨髓等组织器官[1-2]，因此，一般认为在死者内部组织器官中检出硅藻等浮游生物是诊断溺死的一种可靠依据[3-6]。
浮游生物中关于硅藻检验的研究较多。经典的硅藻检验方法一般先通过强酸消化法、胰蛋白酶消化法等去除组织中的有机质，然后富集组织消解液中的硅藻，在显微镜下根据硅藻的形态进行观察和分类[7-10]。在此原理基础上，研发了微波消解-真空抽滤-自动扫描电子显微镜（microwave digestion -vacuum filtration -automated scanning electron microscopy，MD-VF-Auto SEM）法，其可靠性在多年来的实践中得到证实[9-10]。近年来，以分子生物学技术检测浮游生物相关靶基因用于溺死诊断成为法医学领域的研究热点，并研发了一种包含12 对特异性引物的浮游生物基因复合扩增体系[11]，且具有良好的特异性和稳定性。
本研究拟应用MD-VF-Auto SEM 法和浮游生物基因复合扩增体系，对10例非溺死案件和50例溺死案件进行分析，比较2 种方法在法医学鉴定中的应用效能。
1.1 样本
收集广州市刑事科学技术研究所2020 年5 月—2021 年5 月鉴定的10例陆地上死亡的非溺死尸体（编号1～10 号）和50例溺死尸体（编号11～60 号）。溺死的诊断依据为通过案情调查或有目击者确认溺死，具有溺死的典型病理特征[5]，排除镇静催眠类、有机磷类、毒品及灭鼠药类等常规毒（药）物中毒。非溺死案例的死因为颅脑损伤、机械性窒息和电击死。根据《法庭科学 硅藻检验技术规范 微波消解-真空抽滤-显微镜法》（GA/T 1662—2019）[12]进行组织样本提取，样本置于-80 ℃冰箱冷冻保存以进一步检验。本研究由广州市刑事科学技术研究所批准。
每例分别提取肺组织2 g、肝组织10 g、肾组织10 g，用于MD-VF-Auto SEM 法。每例分别提取肺组织、肝组织、肾组织各0.5 g，用于浮游生物基因复合扩增体系检验。
1.2 MD-VF-Auto SEM 法
1.2.1 组织处理
提取的肺、肝、肾组织分别置于消解管中，加入8 mL 65%硝酸溶液（德国Merck 公司）和2 mL 30%过氧化氢溶液（德国Merck 公司）。
1.2.2 微波消解
将消解管置于Multiwave 7000 微波消解仪（奥地利Anton Paar 公司）中进行消解。程序设定：5 min 内功率由0 W 升至800 W，保持10 min；
强风冷却30 min。
1.2.3 真空抽滤
水样与硝酸以体积比5∶1 加入纯水置消解管中，倒入滤杯中使用HL-6 多联真空抽滤仪（珠海黑马医学仪器有限公司）抽滤。取出滤膜烘干制备样品座。
1.2.4 扫描电子显微镜观察
将样品座置于Phenom XL G2台式扫描电子显微镜（美国PhenomWorld 公司）下观察，放大倍数400 倍，记录观察到的硅藻总数。
1.3 浮游生物基因复合扩增体系检验
1.3.1 引物设计
浮游生物基因复合扩增体系由12 对引物组成（表1），分别针对硅藻、蓝藻和气单胞菌的特异基因，选取其在GenBank 数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）中的特异性基因，使用Applied BiosystemsTMPrimer ExpressTMv3.0.1 软件（美国Thermo Fisher Scientific 公司）设计特异性引物。将引物分为2 组，分别用FAM、HEX 荧光标记。
表1 12 对PCR 引物信息Tab.1 The information of 12 PCR primers
1.3.2 DNA 提取
提取的肺、肝、肾组织剪碎后分别置于2 mL 微量离心管中，加入10 μL PK、10 μL 二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）及700 μL 细胞裂解液。微量离心管放入ThermoStatTMC 孵育器（德国Eppendorf 公司）进行预处理：56 ℃ 3 h。根据PowerSoilTMDNA Isolation试剂盒（德国Qiagen 公司）说明书提取DNA，-20 ℃保存待检。
1.3.3 聚合酶链反应-毛细管电泳技术
PCR 在VeritiTM96 孔热循环仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）中进行。10 μL PCR 扩增反应体系：反应混合液4 μL，引物2 μL，C-TaqDNA 聚合酶0.4 μL，DNA 模板1 μL 和灭菌双蒸水2.6 μL。反应条件：95 ℃2 min；
94 ℃30 s，59 ℃1 min，72 ℃1 min，30个循环；
72 ℃10 min。
在3130xl基因分析仪（美国Applied Biosystems公司）中进行毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）分离，上样体系：扩增产物1 μL，AGCU Marker SIZ-500 0.5 μL 和去离子甲酰胺10.0 μL。使用Gene-MapperID-X1.4（美国Thermo Fisher Scientific 公司）进行结果分析，并将峰值检验阈值设置为100 相对荧光单位（relative fluorescence units，RFU）。
1.4 统计学分析
肺、肝、肾组织检出硅藻或浮游生物基因，即判断为检出阳性；
肺组织检出阳性的基础上，肝、肾任一组织检出阳性即判断为溺死。采用SPSS 24.0 软件（美国IBM 公司）进行统计分析。根据数据分布形式，将MD-VF-Auto SEM 法与浮游生物基因复合扩增体系检验阳性率进行χ2检验，检验水准α=0.05。
2.1 MD-VF-Auto SEM 法检验结果
50例溺死尸体肺组织硅藻含量为（197 847.10±354 617.77）个/10g，肝组织硅藻含量为（68.56±228.51）个/10 g，肾组织硅藻含量为（1 671.46±10 115.07）个/10 g；
10例非溺死尸体肺组织均未检出硅藻，有6例肝或肾组织中检出了少量硅藻（2～8 个/10 g）。如表2 所示，50例溺死尸体总阳性率为100%。
表2 50例溺死尸体各组织的阳性率Tab.2 The positive rates of samples of 50 drowning cases
2.2 浮游生物基因复合扩增体系检验结果
50例溺死尸体肺组织基因座平均检出（5.96±3.74）个，肝组织基因座平均检出（2.00±2.07）个，肾组织基因座平均检出（2.78±3.25）个；
10例非溺死尸体的肺、肝或肾组织均未检出硅藻基因座。如表2所示，50例溺死尸体总阳性率为84%。溺死尸体肺、肝、肾组织硅藻基因分型的典型图谱见图1。
图1 浮游生物基因复合扩增体系检验溺死尸体的基因分型图谱Fig.1 Genotyping map of drowning cases examined by plankton gene multiplex PCR system
2.3 两种方法的比较
从实验过程来看，浮游生物基因复合扩增体系检验相较MD-VF-Auto SEM 法操作步骤简单，耗费的时间更短。从统计分析结果来看（表2），MD-VFAuto SEM 法与浮游生物基因复合扩增体系在肝、肾组织的阳性率和总阳性率之间差异均有统计学意义（P＜0.05），但两种方法对肺组织硅藻的检出阳性率之间差异无统计学意义（P＞0.05）。
硅藻是一种单细胞水生生物，广泛分布于各种自然水体，具有复杂的种群动态与生态学特征[13]。硅藻检验最广泛使用的方法是强酸消解、离心和光学显微镜观察。传统的硅藻检验方法由于灵敏度不高、具有一定的假阳性率，其辅助溺死诊断的价值受到一定程度的质疑[14-15]。
MD-VF-Auto SEM 法与传统的强酸消化法等相比，具有更高的灵敏度和特异性[9-10]。相比反复的离心富集，0.45 μm 孔径的滤膜（硅藻最小长度＞1 μm）可以实现更高的硅藻回收率[16]，而且具有较高分辨率的扫描电子显微镜更容易观察到硅藻的微观结构。一般来说，除肺组织检出硅藻外，在肝或肾组织中至少有1 个组织检出硅藻才可诊断为阳性[17]。本研究结果显示，50例溺死尸体的肺、肝、肾组织阳性率分别为100%、96%、98%，总阳性率为100%。尽管3 种组织的阳性率都很高，但检出的硅藻含量却存在较大差异。肝或肾组织中检出的硅藻含量低至1～10 个/10 g，而在肺组织中检出的硅藻含量可高达几十万个/10 g。通过对各组织的硅藻量化分析，可以对溺死进行更准确的判断[18-20]。部分非溺死尸体的肝、肾组织中也可以观察到一些硅藻，但其数量极少（2～8 个/10 g），这可能是生前进入人体并留存在组织内的硅藻，这与之前的非溺死尸体硅藻分布研究结果[21]相似。通过硅藻量化分析，原本存在体内组织的少量硅藻不影响溺死诊断[17-20]。
本研究所使用的浮游生物基因复合扩增体系包含12 对引物，不仅可检出9 种硅藻，而且还可以检验出7 种蓝藻和5 种气单胞菌[11]，这些都是水体中常见的水生生物，其体积更小，在溺死过程中更容易通过气-血屏障进入体循环。理论上，检出ND-A、ND-B和UPA表明存在硅藻，CBR表明存在蓝藻，rPOD-A、rPOD-B、HLYA-A、HLYA-B、HLYA-C、AER-A、AER-B和AER-C表明存在气单胞菌。而本研究中浮游生物基因复合扩增体系在10 个非溺死尸体的肺、肝、肾组织中均未检出以上12 个基因座，这可能是由于无法在活体组织内存活，死亡后硅藻DNA 降解，只有硅藻的硅质细胞壁被保留在组织内。浮游生物基因复合扩增体系有助于排除生前体内的硅藻沉积，只能检出进入组织的新鲜浮游生物。浮游生物基因复合扩增体系对50例溺死尸体肺、肝、肾组织的阳性率分别为92%、78%、76%，总阳性率为84%。肝、肾组织的阳性率和总阳性率均低于MD-VF-Auto SEM 法（P＜0.05）。虽然浮游生物基因复合扩增体系检验的浮游生物更多，但受限于取样量（0.5 g），使其阳性率低于MD-VF-Auto SEM 法。
MD-VF-Auto SEM 法以传统的硅藻检验方法为基础发展而来，其灵敏度高、结果可靠，是目前辅助溺死诊断的主要实验室依据[9-10]。但其所需设备较昂贵，对专业人员操作要求较高，在基层推广使用有一定困难。浮游生物基因复合扩增体系的优势在于可以检出除硅藻外的其他与溺死相关的浮游生物，且从检验过程来看，其操作简便，耗费时间更短。但随着尸体存放时间延长，尸体内的浮游生物DNA 可能会降解，浮游生物基因复合扩增体系可能会出现假阴性结果。目前我国区级公安机关已经配备CE 设备，浮游生物基因复合扩增体系更适用于大规模检测应用。当遇到疑难案件怀疑为溺死，浮游生物基因复合扩增体系检验结果阴性时，可采用MD-VF-Auto SEM 法进一步确证。综上所述，基于硅藻形态学检验的MD-VF-Auto SEM 法与浮游生物基因复合扩增体系各有优势，可在不同的应用场景中选择相应的方法进行溺死诊断分析，两者相结合可为溺死的诊断提供更加可靠的依据。
猜你喜欢 阳性率引物尸体 香合欢EST-SSR标记开发及种间通用性研究广西植物(2022年8期)2022-09-07甜菜全基因组SSR引物的筛选与评价中国农学通报(2022年12期)2022-06-01破伤风抗毒素复温时间对破伤风抗毒素皮试阳性率的影响健康护理(2022年3期)2022-05-26视频宣教结合回授法对肺结核患者病原学阳性率的影响中国典型病例大全(2022年11期)2022-05-13Parkinson and Hypericum perforatum: a medical hypothesisTMR Integrative Medicine(2022年12期)2022-05-13马铃薯SSR引物的开发、特征分析及在彩色马铃薯材料中的扩增研究作物学报(2022年4期)2022-02-10破伤风抗毒素复温时间对破伤风抗毒素皮试阳性率的影响医学概论(2021年19期)2021-01-21打败仗小猕猴智力画刊(2019年11期)2019-12-10有关PCR扩增过程中的疑虑与剖析中学生物学(2019年7期)2019-10-17生命的起源，也许只是一具尸体？军事文摘·科学少年(2017年1期)2017-04-26