宋燕莉，郭 鑫，吴 鹏，韩作颖，牛江露
（1.晋能控股集团有限公司 煤与煤层气共采国家重点实验室，山西 晋城 048000；
2.易安蓝焰煤与煤层气共采技术有限责任公司，山西 晋城 048000）
微生物增产煤层气技术是利用煤层的本源微生物原位降解煤来实现产气的一项技术，该技术可产生新生煤层气，并且绿色安全、有一定的经济潜力，成为国内外学者研究的热点[1]。M.S.GREEN 等[2]对美国粉河盆地煤层气田产出水中降解煤产甲烷的微生物菌群进行了富集。S.H.HARRIS 等[3]研究了美国粉河盆地和Fort Yukon 地区煤样的生物产甲烷情况，发现影响煤层产甲烷的主要因素是煤中有效生物底物和不同微生物菌群之间的竞争。P.H.FALLGREN 等[4]研究了澳大利亚、印度尼西亚和中国等地的褐煤煤样被本源微生物降解产甲烷情况，证实了可以通过添加营养物质激活本源微生物进行产气。王爱宽[5]对我国云南昭通褐煤本源菌生气特征和作用机理进行了研究。与实验室模拟条件相比，煤层原位情况要复杂得多。Luca Technologies 公司在美国粉河盆地进行了微生物增产煤层气的现场试验，对煤层降解和菌群结构进行了深入研究，并提出相应的微生物增产煤层气实施方案[6]。
赵庄井田位于沁水盆地中段东部，井田低软松渗、构造复杂，煤层气地面抽采效果一直不理想，井下抽采投资大、效果差，采用微生物增产煤层气技术可增加煤层气储量、提高煤层气采收率、延长煤层气井服务年限。为加快微生物转化速率、提高煤层菌活性，需要向煤层补充合适的营养剂。煤与煤层气共采国家重点实验室以赵庄115 煤层气井（zz-115）排采水为水样，在实验室厌氧模拟培养及连续发酵放大培养的基础上，进行了zz-115 现场注入培养基增产煤层气工业试验，并检测了甲烷产量及离子变化情况，现介绍如下。
1.1 煤的物化特征
赵庄地区煤层包括山西组3#煤层和太原组15#煤层，该地区煤主要为腐植类高变质煤，有机煤岩组分以镜质组为主，灰分低，煤层气吸附较大。赵庄地区煤样的工业分析和元素分析见表1。
表1 赵庄地区煤样的工业分析和元素分析
1.2 水样厌氧采集菌群的观察及检测
将zz-115 排采水样装入充满氮气的无菌厌氧瓶，并添加还原剂保证厌氧环境。采用OLYMPUS BX-41荧光显微镜在420 nm 波长下观察水样里有无产甲烷菌。在无菌条件下，用0.22 μm 的微孔滤膜过滤水样，将滤膜保存在-80 ℃的冰箱内，用于DNA 提取测序。对提取到的基因组DNA 进行琼脂糖电泳检测，查看基因组DNA 的完整性与浓度，精准定量PCR 反应加入的DNA 量，PCR 引入测序平台通用引物。PCR 反应结束后，对PCR 产物进行琼脂糖电泳，对DNA 进行回收，将回收的产物用Qubit2.0 荧光定量仪定量，根据测得的DNA 浓度回收DNA，可用于后续样品的建库与测序。
通过软件处理将样品序列进行物种分类，根据分类学分析结果，直观地观测样品在不同分类水平的菌群结构。
1.3 实验室厌氧模拟培养及连续发酵放大培养
在100 mL 厌氧瓶中放入20 mL 产甲烷菌富集培养基，培养基由2.0 g/L 酵母提取物、2.9 g/L K2HPO4、1.5 g/L KH2PO4、0.4 g/L MgCl2、1.8 g/L NH4Cl、0.5 g/L半胱氨酸、1 mL 复合维生素和1 mL 微量元素组成，对培养基进行灭菌后，放入DWS 厌氧手套箱中。水富集培养、水煤共富集培养各设置3 组平行对照，不加培养基的水空白和水煤空白各设置1 组。除培养基外，水富集培养实验组还需加入40 mL 水样，水煤共富集培养实验组需要加入40 mL 水样和5 g 破碎成小块状的煤。空白组以20 mL 纯水代替培养基，水空白实验组还需加入40 mL 水样，水煤空白实验组需加入40 mL水样和5 g 破碎成小块状的煤。培养基、水样、煤样分装均在厌氧手套箱中进行，在25 ℃温箱培养。持续监测产气量5 个月。
厌氧菌连续发酵放大模拟装置示意图见图1。放大密封罐体比例与厌氧瓶近似，在放大密封罐体中放入40 L 灭菌的产甲烷菌富集培养基、80 L 水样和10 kg煤，用N2反复置换罐体，使其保持厌氧环境，在25 ℃培养观察。每日取气，记录产气变化。
图1 厌氧菌连续发酵放大模拟装置示意图
1.4 培养液现场注入试验及技术探讨
注入流程：（1）前期准备：关闭煤层气井现场原管线阀门，抽出油管。之后重新放入新油管至煤层顶板5 m～10 m，安装井口法兰，将注培养液管线连接到法兰接口。（2）注入阶段：在井筒中注满清水，同时打开井口一侧阀门，排空空气后关闭阀门，停止注入清水。注入50 m3培养基和相应比例的还原剂Na2S·9H2O、NaHCO3，然后注入20 m3清水，将排采管柱内培养基和清水全部注入煤层中后停泵（注入速度控制在2 m3/min）。（3）预排采：待井内压力下降后，拆除连接管线，安装好排采设施。封井3 个月，运行后观察甲烷产量、水中离子浓度、菌群数量等的变化。
2.1 排采水中产甲烷菌观察
排采水样的荧光显微镜图（400×）见图2。由图2可知，水样中出现了蓝绿色荧光，说明存在产甲烷菌。
图2 排采水样的荧光显微镜图（400×）
2.2 注入培养基前后煤层菌群对比
注入培养基前后煤层细菌科类丰度对比见表2。由表2 可知，注入培养基前，细菌的主要门类为变形杆菌门、厚壁菌门、拟杆菌门，分别占比58.84%、8.89%、21.27%。拟杆菌门是降解纤维素的菌群；
厚壁菌门的主要作用是糖代谢，如链球菌科的乳球菌属；
变形杆菌门是细菌域中的最大一门，含降解芳香化合物、蛋白质、脂肪、糖类作用的菌群，一些利用醇、胺类的菌群，硫酸盐还原菌也属于该门中的一类，能减少硫酸盐对产甲烷菌的毒害。从煤层菌群原始结构看，煤层中存在完整的产甲烷菌群生态系统。在注入培养基六七个月后，水样中的菌群结构发生了变化：厚壁菌门比例增至21.56%，拟杆菌门比例降至10.46%，变形杆菌门降至52.43%，放线菌门增至8.59%；
原优势菌种所占比例逐渐降低，物种之间丰度的差距逐渐缩小，同时很多丰度较低的物种在获得足够的营养后快速繁殖；
菌群多样性增加，更利于产气。
表2 注入培养基前后煤层细菌科类丰度对比
注入培养基前广古菌门的甲烷杆菌科占多数（99.32%），注入培养基后出现了甲烷螺菌科（占比8.94%）和氢代谢型甲烷菌（占比15.28%）。依据产甲烷的途径划分，这些甲烷菌的类型为H2/CO2型，说明产甲烷的途径是H2/CO2还原途径。
2.3 实验室厌氧瓶发酵及放大培养模拟结果
在实验室厌氧瓶发酵中，赵庄水富集和水煤共富集产气趋势分别见图3、图4。由图3、图4 可知，水富集和水煤共富集的产气趋势均为缓慢上升到稳定，水富集最高甲烷产量为0.29 mL/d，水煤共富集最高甲烷产量为4.08 mL/d。加煤的产气量比不加煤的要高，说明在菌群适宜的营养条件下，煤可被生物利用产气。水煤共富集放大培养产气趋势及压力见图5。由图5可知，水煤共富集放大装置的产气趋势同样为缓慢上升到平稳，甲烷产量可达5.5 m3/d。
图3 实验室厌氧瓶水富集产气趋势
图4 实验室厌氧瓶水煤共富集产气趋势
图5 水煤共富集放大培养产气趋势及压力图
2.4 现场注入试验的产气和水中离子变化
zz-115 井封井结束开始运行后动液面连续下降，平均甲烷产量由原来的3 m3/d 增至11 m3/d 左右，菌群数量稳定10-9～10-8数量级。注入培养液后离子浓度变化见表3。
表3 注入培养液后离子浓度和水质指标变化（质量浓度） mg/L
由表3 可知，水中阳离子Mg2+、K+、Na+、氨氮和阴离子F-、Cl-浓度先升后降浓度总体下降，浓度整体上升；
矿化度、重碳酸盐、总碱度、硬度总体先升后降。阴阳离子等水质监测指标基本都随着培养基的注入、井的正常运转降低，判断离子浓度的降低或是随着地下水流失，或是被微生物生长利用。
培养基一次性注入排采可能存在注入后流向不明、流失较多的问题，为了解决这一问题，提出一种培养基补加循环装置的设想。这种方式可保证培养基的持续稳定供给，对要富集的菌群作用时间长，极大地提高了产气的可能性，地下注入培养基补加循环系统示意图见图6。补加培养基时打开阀门7，使排采井水流入蓄水池，待井水积累到一定体积时，开启泵4 将井水泵入培养基罐，启动泵5 自循环。打开阀门9、10对培养基罐充氮气以除氧。培养基罐保持0.1 MPa 微正压，关闭阀门7、启动泵6、打开阀门8，将培养基注入排采井1。之后封井一段时间，然后打开阀门7 排采并检测排采水浓度，若低于初始培养基浓度，需重新添入培养基，重复上述循环。
图6 地下注入培养基补加循环系统示意图
采用地下注入培养基补加循环系统连续注入培养基，产气效果好，经济效益可观。按一口井多产甲烷50 m3/d、甲烷市价2 元/m3计算，一年可获得收入3.65 万元，除去设备、管线、用料、人力等成本1.5 万元/a，净利润达2.15 万元/a，而且比盲目重复一次培养基注入节省了人力。地下注入培养基补加循环系统的使用对沁水盆地南部煤层气增产有实际意义，若能使培养基的某些成分由廉价物替代，原位煤的生物转化就更经济实用。
4.1 实验室厌氧瓶模拟结果表明，煤层水和煤的共富集产气量高于煤层水的富集产气量，说明煤在产甲烷中起到一定作用。发酵罐放大模拟结果表明，产气持续两个月后，产气量仍可达5.5 m3/d。
4.2 煤层气井现场注入培养液后，产气量增长，阴阳离子等水质监测指标基本呈下降趋势，可能是注入后随着地下水流失或被菌群生长利用。
4.3 从煤层菌群原始结构看，赵庄煤层中存在完整的产甲烷菌群生态系统，注入培养基后，菌群多样性增加，更利于产气。
4.4 培养基一次性注入排采存在弊端，培养基补加循环系统能有效解决这一问题，并可带来一定的经济和社会效益。
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