翟 颀，黄敏霞,.2，吕殿红,3，贾春玲，周秀蓉，温肖会,3，罗胜军,3
（1.广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站广东 广州 510640；
2.仲恺农业工程学院动物科技学院，广东 广州 510225；
3.岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心，广东 肇庆 526238）
牛结节性皮肤病（Lumpy Skin Disease,LSD）是一种由牛结节性皮肤病病毒（Lumpy Skin Disease Virus，LSDV）引起的高度传染性疫病。临床上，发病牛通常发热（40～41.5 ℃）并持续1～3 d，体重减轻，产奶量减少或停止产奶，流涎、流泪和流脓性或粘脓性鼻涕，全身淋巴结体积增大，单个或多个圆形皮肤结节局部性或广泛性出现，多出现在头部、颈部、背部、乳房、会阴、生殖器、四肢和尾巴等毛发稀疏区域［1］。皮肤结节溃烂会招引蝇蛆而继发细菌感染，伤口数月无法愈合，最后留下可深入到肌肉组织的永久性痘疤，严重降低皮革制品的质量［2］。LSD 发病率差异很大（5%～90%），死亡率通常较低（10%以下），但在个别疫情中可达到85%，偶发巨大差异的死亡率可能与牛品种、毒株毒力、动物健康状态以及传播媒介类型等密切相关［3-4］。LSD 给疫情国家的养牛业造成重大经济损失［5-7］。该病被世界动物卫生组织列为必须报告的牛疫病之一，我国农业农村部也将其列为二类动物疫病。
1929 年LSD 首次发现于非洲的赞比亚，之后几十年主要在撒哈拉以南的非洲地区和国家呈地方性流行［8-10］。20 世纪80 年代后期LSD 开始侵入中东国家，科威特是非洲以外首个发现LSD 的国家，之后LSD 迅速扩散［11-12］。2013 年土耳其首次报告LSD 疫情，由此LSD 抵达欧洲东南部，持续影响10 多个欧洲国家［13］。2015 年俄罗斯首次暴发LSD 疫情，2016 年哈萨克斯坦在距离俄罗斯边境80 km 的地方第一次报告LSD 疫情［14］。2019 年LSD 首次扩散到亚洲东部和南部，中国、印度和孟加拉国均有报告。自2020 年以来LSD先后暴发于 尼泊尔、不丹、越南、缅甸、斯里兰卡、泰国、马来西亚、柬埔寨、老挝和蒙古［15］。我国首次确诊的LSD 病例发生在2019 年8 月新疆维吾尔自治区伊犁州［16］，此后LSD 疫情迅速扩散，据中国动物疫病预防控制中心公布，目前国内LSD 疫情已波及安徽、福建、江西、广东、浙江、台湾、四川、重庆、香港、内蒙古、山东、广西、宁夏、海南、陕西和云南。本文着重就近年来LSD 的病原学及病原基因组的研究进展进行综述，以期对LSD 的防控和深入研究提供借鉴。
1.1 LSDV 的分类及形态结构
LSDV 是LSD 的病原体，属于痘病毒科（Poxviridae）脊索痘病毒亚科（Chordopoxvirinae,ChPV）［17］，与山羊痘病毒（Goatpox virus,GTPV）和绵羊痘病毒（Sheeppox virus,SPPV）均为山羊痘病毒属（Capripoxvirus，CaPV）。目前在血清学上无法区分LSDV、SPPV 和GTPV，三者还可以发生交叉反应。从一种CaPV 感染恢复后，可对其他CaPV 产生免疫力。
痘病毒是最大的动物病毒，病毒粒子呈砖形或卵圆形，LSDV 大小约为290 nm×270 nm［18］。宿主细胞质是LSDV 的复制场所，LSDV 感染细胞时主要以细胞外包膜病毒（Extracellular Enveloped Virus，EEV）和细胞内成熟病毒（Intracellular Mature Virus，IMV）形式存在，但主要以稳定性更好的IMV 形式存在于细胞内，直至细胞裂解后感染另一个宿主。EEV 由IMV 发展而来，其包被来源于高尔基体或内质网的囊膜［19］，与IMV可通过形态结构上是否有包膜包被而进行区别。IMV 或EEV 最里面部分是一个中间内凹、形似哑铃状的核心，核心由线性双链DNA 和多种酶组成（图1）；
靠近核心的是栅栏状核心膜；
核心凹陷的中心是性质尚未清楚的侧体；
核心和侧体一起被2 层脂溶性外膜包围，厚度为50～55 nm；
病毒外膜上还有很多不规则分布的管状结构蛋白，使裸露的病毒粒子表面呈现纹理结构［20-21］。
图1 LSDV 病毒粒子形态结构［21］Fig.1 Morphological structure of LSDV virus particles
1.2 LSDV 的理化性质和生物学特性
LSDV 不耐热，一般55 ℃ 加热2 h，或65 ℃加热30 min，均可使其灭活［22］。LSDV 也不能被阳光直射，不耐酸或碱，对大多数常用消毒药敏感。在pH 6.6～8.6 条件下，LSDV 非常稳定，37 ℃细胞培养5 d 没有明显降低病毒滴度。LSDV耐冻融，用细胞培养液4 ℃保存6 个月，或用皮肤结节组织-80 ℃保存10 年，LSDV 均可以恢复毒力。
LSDV 可用敏感细胞培养，但是细胞可供选择的范围很窄，传统上使用牛、山羊和绵羊等反刍动物来源的原代细胞培养，如羔羊睾丸细胞（LT）、羔羊肾细胞（LK）、胎牛肌肉细胞（FBM）和胎牛皮肤细胞（FBS）。这些原代细胞系容易被污染，生产过程耗时耗力且有违动物福利。绵羊睾丸细胞（OA3.Ts）也可以支持LSDV 的增殖，但是该细胞和原代细胞一样，生长缓慢，传代次数有限［23］。因此，越来越多研究工作者使用牛肾细胞（MDBK）进行病毒分离，这是目前增殖LSDV 较优的细胞选择。由病牛的皮肤结节和痂皮都含有高浓度LSDV 可知，LSDV 对上皮细胞具有嗜性［24］，而MDBK 细胞是一种源于LSDV 本体宿主牛的肾脏细胞，可贴壁生长，具有上皮特性，而且MDBK 细胞较原代细胞和O A3.Ts 细胞具有生长速度快、不易污染、成本低等优越性。有学者发现MDBK 细胞不但适用于从临床样本分离LSDV，还适用于生产LSDV 减毒活疫苗［25］，有利于解决目前使用原代细胞生产疫苗时难以保证不被外源因子污染的质量问题。也有科学家使用非洲绿猴肾细胞（Vero）培养改造后的LSDV分离株，在培养细胞中也能产生较高的病毒滴度［26］。此外，LSDV 可以通过鸡胚接种分离［27］。在LSDV 的动物感染实验中，采用静脉注射接种较皮内接种的临床症状更明显。
2.1 LSDV 基因组结构
CaPV 的3 种病毒均高度保守，相似性高达96%，LSDV 基因组几乎包含了SPPV 和GTPV 的所有基因［28］。LSDV 基因组有约151 kb，G+C 含量很低，有1 个保守的中央编码区，两端是变异程度较高的反向末端重复序列（Inverted Terminal Repetitions，ITRs），大小约为2.4 kb［29］。LSDV基因组最多有156 个开放阅读框（Open Reading Frame，ORF），中间保守基因编码的蛋白质涉及DNA 复制、转录、mRNA 合成、核苷酸代谢、结构形成和稳定、毒力和宿主范围，基因组两端则是基因家族与毒力和宿主范围功能密切相关的基因，如LSDV132 作为LSDV 独特的基因，可能行使毒力和宿主范围功能，而在SPPV 和GTPV 基因组中受破坏而限制了宿主范围［30-31］。
2.2 LSDV 基因组测序研究
2.2.1 对非洲地区LSDV 毒株全基因组的研究 LSDV 起源于非洲，2001 年科学家对1958 年在肯尼亚首次分离的Neethling 2490 毒株进行了全基因组序列测定分析，该病毒株在分离后接种于LT 细胞培养16 代，并在1987 年回归奶牛接种传代［28］。提取的病毒DNA 被Tsp509 Ⅰ外切酶剪切成1.0～6.0 kb 大小的片段，在Applied Biosystems PRISM 3700 自动DNA 测序仪上完成双脱氧测序反应。该病毒株的基因组全长150 773 bp，A+T 含量为73%，ITR 有2 418 bp，有156 个ORF，最小读取的ORF 为162 bp，LSDV 的 结构和功能与ChPV 其他属病毒关系密切，尤其牙塔痘病毒属（Yatapoxviruses）和兔痘病毒属（Leporipoxviruses）［28］。
KSGP 0240 株最初从绵羊中分离出来，由于该毒株感染绵羊和山羊只引起轻微的临床疾病，因此被广泛应用于针对GTPV 和SPPV 的免疫，疫苗接种效果很好，但对LSDV 的免疫保护不完全［32］。KSGP 0240 株长期被认为是SPPV，直到有学者测出KS-1 毒株（来源于KSGP 0240 减毒疫苗）全基因组序列才开始被认为是LSDV，ORF002、ORF155 和ORF013 在LSDV 毒株（包括KS-1 株）中均完整，而这些区域在SPPV 中均被破坏［33］。后来也有学者从肯尼亚Kenyavac疫苗（JOVAC）中测出KSGP 0240 株基因组序列（KX683219），测序结果与LSDV Neethling NI-2490 具有99.9%的同源性，不同之处仅在于单个氨基酸取代（LSDV049 中的P/Q）和单核苷酸缺失导致LSDV134 被截断［34］。
LSDV 南非Neethling vaccine LW 1959 疫苗株是野外分离株在LK 细胞中连续传代61 次，然后在鸡胚绒毛尿囊膜（Chorioallantoic Membrane，CAM）中传代20 次，再在LK 细胞中传代3次，最后病毒在MDBK 细胞中再传代10 次，在LT 传代5 次后收获以测全基因组序列，与南非Neethling Warmbaths LW 田间分离株比较发现，在基因组末端可变区共有438 处氨基酸替换，包含很多移码突变（造成截短ORF）、缺失和插入，这些突变的编码蛋白主要涉及宿主免疫应答调控、基因表达、DNA 修复和宿主范围特异性以及其他未知功能［35］。2016 年对从纳米比亚分离到的2 株LSDV 进行全基因组测序，结果发现，与Neethling Warmbaths LW 株相比有12 处相同的单核苷酸突变和2 处相同的氨基酸缺失；
此外，Namibia/9/2016 有5 nt 突变，Namibia/10/2016 有27 nt 突变［36］。
2.2.2 对欧洲地区LSDV 毒株全基因组的研究 欧洲大陆第1 株LSDV 分离株是2015 年从希腊分离到的E vros/GR/15 株，该株病毒基因组有150 554 bp，A+T 含量为74.11%，ITR 有2 190 bp，与Neethling Warmbaths LW 株相比同源性为99.8%，存在9 个非同义SNP 突变（LD005、LD006、LD017、LD042、LD054、LD094、LD126和LD128），LD096 有1 个氨基酸缺失，3 个基因（LD013a、LD026a 和LD144）中存在移码突变［37］。同年，俄罗斯从其北高加索地区分离到LSDV/Russia/Dagestan/2015 株，全长150 751 bp，与Evros/GR/15 株、Neethling Warmbaths LW 株相比同源性分别为99.9%、99.8%，该株病毒共有4个SNP 位点突变，1 个在LD145 和LD146 基因间隔区发生T/A 突变，1 个在LD076 中发生C/T 突变，2 个在LD128 中发生G/A 和T/A 突变并引发编码氨基酸变化；
此外，LD141 缺失1 个氨基酸，LD022 中有6 个碱基插入造成编码氨基酸变化［38］。
2016 年对从塞尔维亚分离到的SERBIA/Bujanovac/2016 株进行全基因组测序，全长150 661 bp，ITR 有2 367 bp，与Neethling Warmbaths LW 株的同源性为99.95%，有12 个基因发生氨基酸突变，其中LD005 发生D/N 突变，LD006 发生E/K 突变，LD017 发生H/R 突变，LD059 发生C/F 突变，LD087 发生K/E 突变，LD094 发生S/L突变，LD126 发生E/K 和M/I 突变，LD128 发生S/F 突变，LD139 发生M/I 突变，LD148 发生R/K突变，LD096 缺失1 个赖氨酸，并且在ITR 区缺失15 nt；
此外，编码区有11 nt 变化，有8 nt 变化发生在基因间隔区［39］。
值得注意的是，多个LSDV 分离株在ITR 区发生了15 nt（TAAGTGGAAGCCAAT）的缺失，并且这种缺失稳定存在于2012—2017 年的部分流行株，如来自以色列（2012 年）、希腊（2015年）、塞尔维亚（2016 年）、俄罗斯（2015 年和2017 年）以及纳米比亚（2016 年）的分离株［36］。
2.2.3 对LSDV 疫苗毒与野毒重组型毒株的研究 LSDV 基因组具有高度保守性和遗传稳定性，田间分离株基因组间存在极小的遗传变异，疫苗株基因组间也是如此。对LSDV 疫苗株Lumpyvax、Herbivac LS 和Vaccine-OBP 全基因组测序发现，3 种疫苗株与 Neethling vaccine LW 1959 株基因组之间具有99.9%核苷酸同源性，比较发现，3 株疫苗株均在LW056 发生T/M 突变，LW116 发生V/A 突变；
此外，Lumpyvax 和Herbivac LS 疫苗株在LW037 发生G/V 突变，Herbivac LS 疫苗株在LW134 缺失2 nt 造成移码突变而产生截短ORF，Vaccine-OBP 疫苗株在末端非编码区缺失18 nt 且有3 个不影响编码序列的单核苷酸插入或缺失［33］。
2016 年从克罗地亚接种了SIS-Lumpyvax 疫苗后发生不良反应的活牛上采集皮肤结节样本（远离注射部位），分离得到病毒Cro2016 株。在MDBK 细胞传代8 次后测序得到Cro2016 株全基因组序列，该序列与SIS-Lumpyvax 疫苗核苷酸序列100%相似，证明疫苗接种的病毒序列保持稳定［40］。
哈萨克斯坦的弱毒疫苗株Neethling-RIBSP是基于2016 年该国第1 株野毒分离株Kubash/KAZ/16［41］改造，将该毒株在LT 细胞中传代49次、在鸡胚CAM 中传代5 次、再在MDBK 细胞传代33 次后获得。对该疫苗株进行全基因组测序，发现与Kubash/KAZ/16 株的核苷酸同源性为99.96%，存在5处核苷酸突变（4处氨基酸被替换）、4 处基因间隔区的核苷酸插入和3 处大片段核苷酸缺失，其中编码ankyrin 重复蛋白的LD007 缺失16 nt 造成移码突变产生截短蛋白，LD016 缺失18 nt 造成编码OX-2 样蛋白缺失6 个氨基酸［42］。
痘病毒作为大型的双链DNA 病毒，一般情况下相对稳定，在自然环境中不容易发生大的变异或重组。但在人们对痘苗病毒（Vaccinia Virus,VACV）起源的追溯过程中发现不寻常的情况。VACV 是不同痘病毒的复杂混合物［43］，共培养的天花疫苗与其他病毒，包括天花病毒（Variola Virus,VARV）和牛痘病毒（Cowpox Virus,CPXV）等，可能产生重组病毒。在VACV Lister 毒株里存在两个 CPXV 样基因［44］，此外在DPP17 天花疫苗亚克隆的一个区域也发现含有可编码马痘病毒（Horsepox Virus，HSPV）样的SNP 序列［45］。这提示痘病毒也具有重组变异的可能。
2017 年从距离哈萨克斯坦边境60 km 的俄罗斯地区1 头有明显临床症状的奶牛中分离出LSDV/Russia/Saratov/2017 株，其基因组既包含减毒活疫苗的骨架，也包含田间分离株DNA 片段，确定其为第1 株自然发生的重组型毒株［46］。LSDV/Russia/Udmurtiya/2019 株也是从俄罗斯分离出来的重组毒株，可能由减毒Neethling 型疫苗株和肯尼亚KSGP/NI-2490 样田间分离株重组而成，已识别出27 起与LSDV/Russia/Saratov/2017毒株不同的重组事件，发现几种同样的蛋白被反复恢复为野生型的全长蛋白，推测对毒力影响重要，包括含mutT 基序的蛋白（LW086 和LW087）、B 22R 同源物（LW134）和Kelch 样蛋白（LW144）［29］。Biswas 等［31］比较CaPV 疫苗株与分离株，发现了一些编码ankyrin 重复蛋白、Kelch 样蛋白、B22R 同源物、mutT 和超氧化物歧化酶的基因，可能与调节毒力和宿主范围相关。2020 年在我国广东发现了第3 株能引起典型LSD暴发的重组毒株（China/GD01/2020），与2017年和2019 年在俄罗斯发现的2 种重组毒株存在不同的重组模式［47］。
虽然新型重组LSDV 已被证实流行，但LSDV基因组序列的遗传稳定性仍毋庸置疑，因为重组毒株的基因片段都能在LSDV 疫苗毒株或田间毒株中找到近乎100%相似的区域。LSDV 基因组非常庞大，多达156个开放阅读框，假想基因也较多，很多基因编码产物的功能还不确定，尤其是存在于疫苗毒株和野毒株基因组之间的碱基突变、缺失和插入造成的变异基因功能尚无法确定。
LSD 是一种对国际贸易有重大影响意义的牛传染病。目前防控LSD 仍依赖减毒活疫苗接种，但减毒活疫苗并非完全安全、稳定和有效。近年来通过对LSDV 全基因组测序分析，在亚洲部分地区发现了疫苗毒株和田间毒株的重组毒株，而且重组毒株可以流行并致病。在我国南方地区，尤其是广东的肉牛养殖主要以小规模散养为主［48］，牛只感染LSDV 的风险较高。目前我国官方推荐使用异源山羊痘AV41 株减毒疫苗来预防LSD。我们对广东地区和广西地区的LSDV 毒株进行全基因组测序分析发现，2020 年两广地区暴发的LSD 疫情均由重组病毒株引发；
对该重组毒株进行病毒重组事件分析，其一个可能的次要亲本正是我国目前在使用的GTPV-AV41 减毒活疫苗（课题组未发表数据）。虽然目前还没有更多LSDV 和GTPV 发生重组的证据，但是为了生物安全，未来需要重新评估部分减毒活疫苗的安全性和有效性，并加紧研发其替代品，如灭活疫苗或亚单位疫苗。
此外，为了控制LSDV 在我国进一步传播扩散，迫切需要在全国更大范围内调查LSDV 的真实流行情况。鉴于LSDV 基因组具有高度保守性和遗传稳定性的特点，需要利用高通量测序技术对国内更多的LSDV 分离株开展全基因组水平测序、序列比较、遗传进化和重组事件分析，以便监测分析国内LSDV 流行毒株的遗传演化过程和重组变异情况，进一步对LSD 疫情溯源提供线索，并为该病防控策略的制定提供科学依据。
猜你喜欢 毒株测序基因组 “植物界大熊猫”完整基因组图谱首次发布军事文摘(2022年16期)2022-08-24我国小麦基因组编辑抗病育种取得突破今日农业(2022年4期)2022-06-01新一代高通量二代测序技术诊断耐药结核病的临床意义中国典型病例大全(2022年11期)2022-05-13宏基因组测序辅助诊断原发性肺隐球菌中国典型病例大全(2022年7期)2022-04-22法国发现新冠新变异毒株IHU科学大观园(2022年2期)2022-01-23奥密克戎毒株为何“需要关注”文萃报·周二版(2021年47期)2021-12-14感染两种新冠变异毒株比利时九旬老人病逝环球时报(2021-07-12)2021-07-12生物测序走在前科学导报(2021年29期)2021-06-03基因测序技术研究进展科海故事博览·下旬刊(2019年6期)2019-04-16