董 烨 张益奇,2,3 张晓頔 胡学佳 戴志远,2,3,*
(1 浙江工商大学海洋食品研究院，浙江 杭州 310035；
2 浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室，浙江 杭州 310035；
3 海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心，辽宁 大连 116000)
鳙鱼(Aristichthysnobilis)是我国淡水鱼养殖的主要品种之一。据统计，2019年我国鳙鱼产量达310.1万吨[1]。在鱼头、鱼片和鱼丸等产品的加工过程中，不可避免地产生了大量的鱼骨、内脏、鱼鳞和鱼皮等副产物。合理利用这些副产物可以减少资源浪费和环境污染，促进渔业的可持续发展。酶解是一种有效利用蛋白质的途径，蛋白质经酶解后有助于改善其物理、化学性质、功能和营养特性，同时也是制备生物活性肽的有效方法。鱼皮中含有丰富的胶原蛋白，经蛋白酶水解后可以获得具有抗氧化和降血压活性的生物活性肽[2-3]。然而胶原蛋白刚性的三螺旋结构，对商品蛋白酶具有较强的抵抗力，使得酶解效率和底物转化率低[4]，因此通常需要在酶解前对胶原蛋白进行预处理。传统的酸碱处理法虽然可以破坏蛋白质结构，但过程繁琐，处理时间长，且会造成环境污染[5]。微波作为一种电磁辐射能，可以通过热波动改变蛋白质结构[6-7]，柔化胶原蛋白刚性的三螺旋结构，增加与酶的接触机会，暴露更多的蛋白质酶切割位点，提高酶解效率。
美拉德反应，又称非酶褐变[8]，是指在含有游离氨基的氨基酸、肽或蛋白质与羰基化合物之间发生的一系列复杂化学反应，会产生一系列具有特殊风味与色泽的物质，能够改善食品的不良味道[9]。蛋白酶水解法制备的水解液通常具有一定的苦腥味，限制了其在食品行业中的广泛应用。因此，可通过美拉德反应对其进行风味改良[10]。Yu等[11]将豆粕水解液进行美拉德反应后获得了具有低苦味高鲜味的美拉德反应产物(Maillard reaction products, MRPs)。此外，美拉德反应对在糖-蛋白质水解物系统中的最终产物抗氧化能力的提高有积极作用[12-13]。美拉德反应产物在改善水解物风味的同时可提高其功能特性[14]。然而，目前对鳙鱼皮水解物美拉德反应产物的抗氧化活性和挥发性化合物的研究鲜见报道。因此，本研究通过微波技术预处理鱼皮，酶解法水解鱼皮胶原蛋白，研究美拉德反应条件对鱼皮水解物(fish skins hydrolysates，FSH)抗氧化活性和挥发性成分的影响。
1.1 材料与试剂
新鲜鳙鱼皮，杭州千岛湖；
碱性蛋白酶，上海源叶生物技术有限公司；
葡萄糖、木糖、核糖，上海国药集团化学试剂有限公司；
乙腈(色谱纯)，德国Meker公司。其余试剂为分析纯。
1.2 仪器与设备
e2695高效液相色谱，美国Waters公司；
SPECTRA MAX190酶标仪，美国Molecular Devices公司；
EM-F2116 MS1微波炉，合肥荣事达三洋电器股份有限公司；
MLS-3781 L高压灭菌锅，日本Panasonic公司；
FE20 pH计，上海梅特勒仪器有限公司；
50/30 μm二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷涂层萃取头，美国Supelco公司；
Trace GC Ultra气相色谱-DSQ II质谱联用仪、紫外-可见分光光度计、Fresco 21冷冻高速离心机，美国Thermo Fisher公司；
DGG-9123A电热恒温鼓风干燥箱，上海森信实验仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 微波预处理 将新鲜鱼皮浸泡于0.1 mol·L-1NaOH溶液中除去杂蛋白后，流水冲至中性，40℃烘干，以料液比1∶20(m∶v)配制成溶液，于700 W微波处理15 min后，冻干，-18℃储存，备用。
1.3.2 水解物的制备 取未处理及微波预处理鱼皮，配制成质量分数为2%的溶液，加入2%碱性蛋白酶，设置酶解温度50℃，溶液pH值8，酶解3 h后，于沸水浴中灭酶10 min，8 000 r·min-1离心15 min，得到鱼皮酶解物上清液，冻干，-18℃储存，备用。
1.3.3 水解度的计算 采用pH-stat法[14]，根据公式计算产物的水解度：
水解度 =B×Nb×(1/Mp)×(1/α)×
(1/htot)×100%
式中，B为消耗NaOH体积, mL;Nb为NaOH浓度, mol·L-1; α为α氨基的解离度;Mp为底物中蛋白质总量, g;htot为底物中蛋白质肽键总数, mmol·g-1。
1.3.4 水解物美拉德反应 选取葡萄糖、木糖和核糖作为参与美拉德反应的糖类，糖比水解物为2∶1(m/m)、pH值7.0，温度分别为90、100、121、135℃，反应时间分别为15、35 min，以美拉德反应产物的褐变程度和抗氧化活性为指标，确定美拉德反应条件及合适的还原糖种类。
1.3.5 接枝度的测定 采用邻苯二甲醛(O-phthalaldehyde, OPA)法测定产物的接枝度。参考Yang等[15]的方法，配制OPA试剂。取200 μL样品加入4 mL OPA，37℃下反应2 min后于340 nm处测定吸光度。根据公式计算产物的接枝度：
接枝度 =(A0-A1)/A0×100%
式中，A0为鱼皮水解物的吸光度，A1为美拉德反应产物的吸光度。
1.3.6 美拉德反应褐变程度测定 测定美拉德反应产物在294 nm(稀释20倍)和420 nm波长处的吸光值，用于表示美拉德反应的程度[16]。
1.3.7 抗氧化活性
1.3.7.1 总抗氧化活性测定 采用铁离子还原法(ferric ion reducing antioxidant power, FRAP)测定总抗氧化活性。参考Benzie等[17]的方法配制三吡啶基三嗪(tripyridyltriazine, TPTZ)工作液(由醋酸盐缓冲液、TPTZ溶液、FeCl3溶液组成，按10∶1∶1的比例混合，现配现用)。取浓度0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1FeSO4溶液各100 μL，分别加入3 mL TPTZ工作液，混匀后于37℃水浴条件下反应10 min，测定593 nm波长处的吸光度值，绘制标准曲线(Y=0.480 2X+0.332 1,R2=0.996 7)。取100 μL样品溶液加入3 mL TPTZ工作液混匀按照上述条件反应后，测定吸光度值，由标准曲线查得相同吸光度值处对应的FeSO4浓度，FRAP值用对应的FeSO4浓度(μmol·L-1)表示，用超纯水代替样品作为空白对照。FRAP值(μmol·L-1FeSO4)=样品抗氧化能力-对照抗氧化能力。
1.3.7.2 1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical, DPPH)自由基清除能力测定[18]将1 mL DPPH溶液(0.1 mmol·L-1)与1 mL样品混合，避光静置20 min，在517 nm处测定该混合物的吸光度(A1)，1 mL样品与1 mL 95%乙醇混合的吸光度(A2)，1 mL超纯水与1 mL DPPH 混合的吸光度(A3)。按照公式计算DPPH自由基清除率：
DPPH自由基清除率 =[1-(A1-A2)/A3]×100%
1.3.7.3 超氧阴离子自由基清除能力测定 采用邻苯三酚自氧化法，参考Zhang等[19]的方法并稍作修改，取0.2 mL样品与5.6 mL 50 mmol·L-1的Tric-HCl(pH值8.2)混合均匀，25℃保温10 min，加入0.2 mL保温于25℃的邻苯三酚溶液(3 mmol·L-1，用10 mmol·L-1HCl配制)，混匀，于325 nm波长下每隔30 s测定吸光度值，记录5 min内的吸光度值变化，计算相应斜率，超纯水做对照，以10 mmol·L-1HCl代替邻苯三酚调零。按照公式计算超氧阴离子自由基清除率:
超氧阴离子自由基清除率 =(K0-K)/K0×100%
式中，K0为对照组斜率；
K为样品斜率。
1.3.8 分子排阻色谱分析 采用Waters e2695高效液相系统分析样品的分子量分布[20]，色谱柱为TSKgel G2000 SWxl(7.8 mm×300 mm，东曹)，检测波长220 nm，洗脱液为45%乙腈-55%水-0.1%三氟乙酸，0.5 mL·min-1等度洗脱30 min，进样量10 μL。采用细胞色素C、碳酸酐酶、抑肽酶和马尿酰-组氨酰-亮氨酸作标准品，得到标准曲线lgM=-0.201 5t+6.852 7，R2=0.972 1，计算分子质量分布情况。其中，M为分子质量，t为保留时间。
1.3.9 紫外吸收光谱扫描 将美拉德产物样品稀释20倍，在200～400 nm范围内进行紫外光谱扫描。
1.3.10 挥发性成分分析[21]固相微萃取(solid phase microextraction, SPME)条件：将4 mL样品置于顶空瓶中于50℃下保温10 min。将活化好的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头插入顶空瓶，60℃吸附30 min，取出后插入GC进样口，250℃解吸3 min。气相色谱(gas chromatography, GC)条件：TR-35 MS色谱柱(30 m× 0.25 mm，0.25 μm)；
高纯氦气作为载气；
进样口温度250℃，不分流进样。升温程序：初始温度35℃，保持3 min，以2.5℃·min-1升至70℃，8℃·min-1升至150℃，最后以20℃·min-1升至230℃，保持5 min。质谱(mass spectrometry, MS)条件：检测器温度280℃；
电子电离源，离子源温度200℃；
传输线温度250℃；
电子能量70 eV；
质量扫描范围m/z 30～500。
1.4 数据处理
试验数据以平均数±标准差(Mean±SD)表示。采用SPSS 21.0软件进行方差分析(ANOVA)，Duncan多重比较法进行显著性检验(P<0.05)，Origin 2019软件作图。挥发性成分通过NIST2.0谱库进行定性分析，仅保留正反匹配度均大于800(最大值为1 000)的鉴定结果。
2.1 水解度分析
由图1可知，经微波预处理后的鱼皮水解物具有更高的水解度，达18.56%，是未处理组(12.07%)的1.54倍。微波预处理使部分蛋白质降解为小分子物质，更易溶出，同时蛋白质结构展开，更易被蛋白酶酶切，因此水解度增大。
图1 鱼皮水解物的水解度
2.2 美拉德反应产物的褐变强度
褐变强度常用于评价美拉德反应的程度。在美拉德反应早期，羰基与氨基反应，生成无色的中间产物，在294处有吸收峰；
随着美拉德反应的继续进行，美拉德反应最终产物类黑精在420 nm处有最大吸收峰，吸光度值越大，褐变强度越高[22]。由图2可知，单独加热鱼皮水解物时，在294和420 nm处的吸收峰几乎没有变化。将葡萄糖、木糖和核糖分别与鱼皮水解物加热进行美拉德反应后，3种美拉德反应产物的紫外吸收随加热温度的升高和时间的延长而增大。核糖美拉德反应产物在加热温度135℃、反应时间35 min时表现出最高的紫外吸收，褐变强度最大，在294和420 nm处的吸光度值分别达1.76和1.65，是葡萄糖美拉德反应产物组的1.64倍和3.17倍。上述结果表明，反应时间和温度，以及糖的种类均会影响美拉德反应的速率和进程。
图2 美拉德反应产物的褐变强度
2.3 接枝度分析
蛋白质分子侧链上的游离氨基脱水与还原糖的羰基缩合，游离态的氨基转变为结合态，结合态氨基含量，即接枝度，可以反映美拉德反应的程度[15]。接枝度越大，表明美拉德反应程度越高。由图3可知，3种糖美拉德反应的接枝度均随反应时间的延长和反应温度的升高而增大，与褐变程度呈正相关。在反应时间和反应温度相同的条件下，核糖美拉德反应产物的接枝度最高，其次是木糖美拉德反应产物。135℃、35 min条件下，核糖美拉德反应产物接枝度最大，为48.60%，木糖美拉德反应产物次之，为44.33%，而葡萄糖美拉德反应产物最小，为38.23%。核糖和木糖美拉德反应程度较高，可能是因为核糖和木糖作为五碳糖，开链程度大，反应活性比六碳糖高。
图3 美拉德反应产物的接枝度
2.4 紫外光谱分析
为进一步研究鱼皮水解物在不同糖的美拉德反应中的程度和结构修饰，比较了在135℃、35 min条件下鱼皮水解物以及3种糖的美拉德反应产物在200～400 nm内的紫外吸收光谱特性，结果如图4所示。鱼皮水解物和3种糖的美拉德反应产物均在218 nm左右出现吸收峰，这是蛋白质和氨基酸的紫外吸收峰。美拉德反应生成类黑精的过程中产生的生色团结构，如呋喃、吡喃和吡咯等化合物在275～278 nm处出现吸收峰。美拉德反应过程中由于游离氨基的损失形成了席夫碱，在280 nm左右波长处出现吸收峰，这一过程是可逆的[23]，而产生的游离氨基可能是由于Heyns化合物在美拉德反应后期不可逆的降解造成的。上述结果表明鱼皮水解物在与糖的美拉德反应中通过席夫碱的形成和Heyns化合物的降解进行修饰[12]。
图4 鱼皮水解产物及美拉德反应产物的紫外吸收光谱
2.5 分子量分布
采用分子排阻色谱法测定未处理组、微波预处理组以及135℃、35 min条件下美拉德反应产物的分子量分布。由图5、图6可知，微波预处理的鱼皮水解物分子量更小，未处理组分子量大于1 000 Da的达53.03%，而微波预处理组大于1 000 Da的仅为19.29%，说明微波预处理可促进胶原蛋白大分子降解成小分子。美拉德反应产物的分子量小于鱼皮水解物，这是由于美拉德反应过程中发生了热降解，导致肽段断裂，使分子量减小。3种糖的美拉德反应产物中，核糖美拉德反应产物中分子量大于300 Da的最多，其次是木糖美拉德反应产物，这是因为美拉德反应过程中肽的交联和聚集产生了新的组分[24-25]。核糖美拉德反应产物反应程度最高，肽的交联和聚集更多，与木糖美拉德反应产物和葡萄糖美拉德反应产物相比，核糖美拉德反应产物中新成分较多，因此分子量大于300 Da的成分最多，这一结果证明还原糖的美拉德反应程度按葡萄糖、木糖和核糖的顺序依次增大。
图5 鱼皮水解物相对分子质量分布色谱图
图6 鱼皮水解物及美拉德反应产物相对分子质量分布色谱图
2.6 抗氧化活性
2.6.1 总抗氧化活性 采用铁离子还原法(FRAP法)[26]测定了微波预处理鱼皮水解物和其美拉德反应产物的总抗氧化能力。通过FeSO4标准溶液的浓度表示总抗氧化能力，浓度越大，表明总抗氧化能力越强。美拉德反应条件为135℃、35 min时，核糖美拉德反应产物的总抗氧化能力最强，其次是木糖美拉德反应产物，葡萄糖美拉德反应产物的总抗氧化能力最弱。随着加热温度的升高，3种糖的总抗氧化能力增加(图7)。核糖美拉德反应产物总抗氧化能力的提高可能归因于中间产物的快速生成，中间产物中的还原酮化合物可以通过提供氢原子而破坏自由基链[27]，从而提高抗氧化能力。
图7 鱼皮水解物及美拉德反应产物总抗氧化活性
2.6.2 DPPH自由基清除能力 由图8可知，鱼皮水解物清除DPPH自由基的能力低于其美拉德反应产物，随着加热温度的升高和反应时间的延长，3种糖的美拉德反应产物对DPPH自由基的清除能力均增大，加热温度的升高和反应时间的延长加速了美拉德反应的进程和焦糖化，因此褐变程度加深，同时发生了肽的降解和交联[24]。反应条件为135℃、35 min时，核糖美拉德反应产物的DPPH自由基清除活性最高，清除率达到96.53%，其次是木糖美拉德反应产物。核糖的反应活性最高，相比于木糖和葡萄糖的美拉德反应产物，核糖美拉德反应产物的中间产物和终产物形成最早，因此DPPH自由基清除能力最高。上述结果表明，糖的反应活性是影响美拉德反应产物清除DPPH自由基的主要因素之一，核糖美拉德反应产物对鱼皮水解物的抗氧化能力具有促进作用。
图8 鱼皮水解物及美拉德反应产物DPPH自由基清除能力
2.6.3 超氧阴离子自由基清除能力 由图9可知，鱼皮水解物对超氧阴离子的清除活性为45.27%，单独加热时变化不明显，而在美拉德反应系统中，随着加热温度的升高和反应时间的延长，3种糖的清除活性增强。在135℃、35 min时核糖美拉德反应产物(88.07%)清除超氧阴离子自由基能力最强，其次为木糖美拉德反应产物(68.69%)和葡萄糖美拉德反应产物(63.22%)。这一结果与其他抗氧化活性测定结果一致，证实了核糖美拉德反应产物在抗氧化活性方面的高反应性。
图9 鱼皮水解物及美拉德反应产物超氧阴离子自由基清除能力
2.7 挥发性成分分析
采用SPME-GC-MS检测了鱼皮水解物以及135℃、35 min条件下3种糖美拉德反应产物的挥发性物质，结果如表1所示。总共鉴定出62种挥发性化合物，其中鱼皮水解物中共检测出19种挥发性化合物，其中47.4%的风味物质为醛类化合物，杂环类化合物仅2种。美拉德反应产物中共检测出50种挥发性化合物，包括3种酮类、13种醛类、11种烃类、3种酯类、1种醇类、5种酸类和14种杂环类。烃类的阈值较高，对产物的整体风味影响不大。酸类、酚类和酯类相对含量较低，对产物的整体风味影响不大。醛类通常是由氨基酸的Strecker降解反应产生。由图10可知，鱼皮水解物中醛类物质相对含量最高，达12.74%，其次是葡萄糖美拉德反应产物，达9.62%。其中，己醛具有果香味，是蔬菜和水果香气的主要成分[27]，在鱼皮水解物中含量较高，美拉德反应后其相对含量减少；
苯甲醛具有樱桃及坚果的香味[28]，在葡萄糖美拉德反应产物中较高。杂环化合物主要有呋喃类和吡嗪类，其中呋喃类物质如呋喃甲醛、乙酰基呋喃等具有甜香和焦香味，是呋喃类杂环化合物的前体物质[29]。吡嗪类具有烤香味，是美拉德反应的主要产物之一；
2,5-二甲基吡嗪具有爆米花香味，甲基吡嗪具有烤香和坚果香[30]。在木糖美拉德反应产物和核糖美拉德反应产物体系中，呋喃甲醛是主要的挥发性成分。Han等[12]也发现呋喃甲醛是扇贝壳水解物-核糖美拉德反应产物中的主要挥发性成分。杂环类的气味阈值较低，对美拉德反应产物的整体感官风味贡献较大，鱼皮水解物中杂环化合物相对含量仅为2.71%，而3种糖的美拉德反应产物中杂环化合物的相对含量均达50%以上。以上结果表明，美拉德反应可以通过形成杂环化合物来增强鱼皮水解物的风味。
表1 鱼皮水解物和美拉德反应产物挥发性成分组成
图10 鱼皮水解物和美拉德反应产物挥发性成分组成和含量
微波法作为一种新型的加热技术，加热速度快且均匀，对物料穿透力强、操作简单、绿色安全，已广泛应用于烹饪和焙烤等食品加工领域。其原理是微波辐射与带电离子和极性分子相互作用，使物料内的分子频繁摩擦损耗以及发生离子迁移，使电磁能转化为热能加热物料[31]。李忍等[31]研究发现高粱蛋白经微波处理后，粒径显著减小，总蛋白质含量得到提高。Zheng等[32]采用微波结合超声预处理牛骨蛋白，提高了牛骨蛋白的水解度和抗氧化性能。而本研究采用微波技术预处理鳙鱼皮，从水解度和分子量分布的结果可以看出，微波处理使鱼皮胶原蛋白的三螺旋结构变得松散，暴露出更多酶切位点，有效提高了酶解效率，酶解产物的水解度更高，小分子肽含量更多。
美拉德反应产物的抗氧化活性是当今食品领域研究的热点。前人研究发现，美拉德反应可以有效提高水解物的功能活性[33-34]。美拉德反应过程中产生的类黑精、还原酮及一些杂环化合物具有良好的抗氧化活性[35-36]。有学者提出将美拉德反应产物加入食品体系，取代合成的抗氧剂，提高产品抗氧化的稳定性[37-38]。本研究发现美拉德反应产物的抗氧化活性与美拉德反应进行的程度有关，与褐变强度和接枝度的变化趋势一致，随反应时间的延长和加热温度的升高，褐变强度增强，其抗氧化活性也逐渐增强。这可能是由于随着美拉德反应的进行，产生了一系列类黑精和杂环化合物，从而提高了产物的抗氧化活性。美拉德反应产物中产生的类黑精是一种色素和小肽结合的具有抗氧化、降血压和抑菌性等生理功能的高分子聚合物混合体，因种类和结构太过复杂，对其形成机理及结构功能还有待进一步研究[39]。美拉德反应产物的挥发性杂环化合物，如呋喃和吡咯等，除了影响其风味特性[40]，还通过引入它们的双键来提高其抗氧化活性。Liu等[41]发现，大豆蛋白水解物的美拉德反应产物中产生的吡嗪、吡咯和呋喃等杂环化合物与Fe2+螯合活性和还原能力显著相关。本研究中，美拉德反应产生的杂环类挥发性化合物对美拉德反应产物的风味增强和抗氧化活性也都产生了影响。本研究中核糖具有较高的反应性，产生了较多含量的杂环类化合物，因此核糖美拉德反应产物具有更高的抗氧化活性。还原糖的种类会影响美拉德反应的程度，从而影响产物的抗氧化活性。Chen等[42]评价了鱼鳞明胶水解物美拉德反应产物的抗氧化活性，发现核糖美拉德反应产物具有最高的抗氧化活性。胡晓等[43]研究了裂壶藻酶解物与不同种类还原糖美拉德反应产物的抗氧化活性，同样发现核糖美拉德反应产物具有最高的抗氧化活性。这可能是因为核糖作为一种五碳糖，碳链短，空间位阻小，相比于六碳糖反应速度大，更易于裂解参与美拉德反应[42]，生成更多的类黑精，增加褐变程度，从而提高产物抗氧化活性，这与本研究结果一致。
美拉德反应在提高水解物功能活性的同时，也产生了一系列结构复杂的物质，其中研究比较热门的主要是晚期糖基化末端终产物(advanced glycation end products, AGEs)[43]。AGEs是美拉德反应的重要产物，化学性质稳定，摄人后会在体内积累，导致诸多慢性疾病，如阿尔兹海默症、糖尿病和动脉粥样硬化等[44]。为了减少本研究美拉德反应产物中的AGEs含量，可以通过控制加工条件来实现，如减少加热时间和降低加热温度，但这可能会影响产物的品质和色香味。因此，可以考虑通过添加一些天然产物来抑制糖化反应的发生[44]，如黄酮和酚类等抗氧化性组分，大蒜、茶和迷迭香等提取物，通过抑制糖链裂解为具有高反应活性的AGEs前体化合物，从而减少AGEs的生成和蛋白质交联[45]。
本研究发现微波预处理有效提高了鱼皮水解产物的水解度和小分子肽的含量，将鱼皮水解产物与葡萄糖、木糖和核糖加热制备美拉德反应产物，评价美拉德反应产物的抗氧化能力和挥发性成分。结果表明，美拉德反应产物的抗氧化能力高于鱼皮水解产物。135℃、35 min条件下美拉德反应产物的褐变程度最高，抗氧化能力较强，还原糖的种类可影响美拉德反应的速率，其中核糖美拉德反应产物比葡萄糖和木糖的美拉德反应产物具有更高的褐变程度和抗氧化能力。挥发性成分分析结果表明，美拉德反应后吡嗪类、呋喃类等杂环类化合物相对含量增多，改善了鱼皮水解产物的风味。美拉德反应对产物的风味和色泽带来积极作用的同时，也有着不可忽视的负面作用，后续可对美拉德反应产物提高抗氧化活性的机理，以及如何有效减少美拉德反应过程中产生的有害物质的含量进行深入研究。
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