生物工程综合实验
-- SＯD工程菌构建
实验报告集
班级 生物工程1411学号
姓名
实验室学生守则
一、严格遵守实验室各项规章制度和管理措施,服从教师及实验技术人员
的指导。
二、严格按照实验要求,做好实验预习,实验之前5分钟进入实验室,及时、
准确地完成实验任务，实事求是地完成实验报告，杜绝弄虚作假。
三、严格执行操作规定，爱护仪器设备及工具。凡不按教师的指导擅自操
作引起仪器、设备损坏者,应予赔偿。
四、爱护实验室公共财物，节约水电、材料和试剂。未经允许不得随便挪
动非实验需用的其他仪器,不得随便拆装仪器或将仪器、工具带至室
外。
五、持实验室的严肃安静,不得大声喧哗、嘻闹，严禁在实验室内抽烟和
吃东西。
六、严防事故,确保实验室安全,发现异常情况,应及时向有关教师和管
理人员报告。
七、每次实验结束后,主动整理好仪器设备,归还所借器材，关闭电源、
水源,按指导老师的要求做好实验结束工作及室内外的清洁卫生工作，
经指导老师许可后,方可离开。
预 习 报 告
名称
SOD工程菌构建
日期
20１71２．11-12．1３
实验目的和要求：工程菌是利用基因工程的方法，将外源基因导入到适当的受体细胞株中，使其得到高效表达。这种经改造后的细胞株称为工程菌。工程菌在基因工程药物、污染治理、生物能源能多方面具有重要作用。
ＳOＤ(超氧化物歧化酶），是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。人体在不断地补充SOＤ后会具有抗衰老的特殊效果,被卫生部批准为具有药物功能的物质。因此,采用工程菌的原理和方法,体外大量合成SＯD,有利于降低其生产成本，扩大使用范围。了解PCＲ的原理和实验流程。了解质粒提取的原理和方法。了解酶切的原理和方法,单双酶切的区别，粘性末端连接和平端连接的差异。了解CaCl2法制备大肠杆菌ＤH５α感受态及转化的原理。了解ＳDS-PAGＥ检测蛋白质的原理和方法。
实验材料：pCM-T-SOD质粒、Tａｑ DNＡ聚合酶、SＯＤ特异性引物、dＮTPｓ PET－32A质粒、质粒提取试剂盒SOＤ基因(PCR回收产物）、PET-32A质粒、EcoRV和HinｄIII限制性内切酶大肠杆菌DH5α,1Ｍ预冷的ＣaCl2溶液，LB培养基，3０％甘油,氨苄青霉素转化成功的菌液，蛋白上样缓冲液，Ｔｒiｓ－Hcｌ，10% ＳDS，ＴEMEＤ,１0% AP(过硫酸铵)，30% 丙烯酰胺单体（29:１）
主要仪器：
ＰCR仪 水平凝胶电泳仪 摇床、超净工作台、离心机、干燥培养箱 垂直电泳系统、水浴锅
主要步骤：
一．PCＲ扩增SOＤ基因及胶回收纯化
PCR扩增
在PCR管中,加入如下PＣR反应物:
名称
体积（μl）
10×Taq buffer
5
SOD上游特异性引物
1
SOD下游特异性引物
1
dNTPs
1.5
质粒模板
3
Taq聚合酶
0.5
无菌水
38
总体积
50
2.PCR反应条件
95
5min
95
30s
30个循环
55
30s
72
1min
72
10min
4
Pause
１% TAE凝胶电泳
胶回收ＰCR产物
1） 琼脂糖凝胶电泳检测PＣＲ产物,若得到目的条带可进行大批量ＰCR，回收目的片段;
2) 通过把切取含DNA片段的琼脂凝胶装在1.5 ｍＬ 小离心管中，称其重量近似地确定其体积,每10０ mg琼脂凝胶相当于1０0 μL 体积。称量每次切取含ＤNA片段的琼脂糖凝胶加入等体积的溶液BD;
3) 5５~65 ℃
４) 将溶液置于DNA纯化柱中，静置2 mｉn，12０00 rｐm离心6０ s；若一次加不完,可分两次离心，弃滤液;
5) 加入50０ μL 溶液PE（初次使用前用无水乙醇按1:４稀释）于离心柱中,1200０ rpm离心6０ s，弃滤液；
6) 用溶液ＰE 500 μL 再洗一遍，12000 rpm离心60 s，弃滤液;12０00 rpm再次离心２ min，以甩干剩余液体；
7) 将离心柱置于新的离心管中,加入60 ℃预热的30~1００ μ
8) 重复步骤７;
9） 无菌水溶解ＤNA，贮存于-20 ℃
二．PET-32A质粒提取
1. 取过夜菌１.５毫升,5000g离心1分钟收集细菌沉淀,弃上清。再重复一次，每管共收集3毫升过夜菌沉淀。
2. 每管加入250微升溶液I，重悬细菌沉淀。确保沉淀完全散开,无可见细菌团块。
３. 每管加入2５0微升溶液ＩI，轻轻颠倒离心管4-６次,使细菌完全裂解,溶液透明。
４. 每管加入350微升溶液III，随即颠倒离心管４-6次混匀，可见白色絮状物产生。
5． 最高速(13，00０rpm左右）室温离心10分钟。
6. 将上一步骤离心后的上清倒入或吸入到质粒纯化柱内。最高速离心30-6０秒，倒弃收集管内液体。
７． 在质粒纯化柱内加入7５0微升溶液IV,最高速离心３0-６0秒,洗去杂质,倒弃收集管内液体。
8. 最高速再离心1分钟,除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。
9． 将质粒纯化柱置于１．5毫升离心管上，加入5０微升溶液V至管内柱面上,放置１分钟。
10. 最高速离心1分钟，所得液体即为高纯度质粒。
11. ０.8% TＡＥ凝胶电泳检测质粒完整性。
三．双酶切SOD基因和PＥT-３2Ａ质粒的双酶切及连接
ＳＯＤ基因和ＰＥT-32A质粒的双酶切
在EP管中，加入如下双酶切体系
名称
加入体积（ul）
10× Buffer M
2
EcoRV限制性内切酶
1
HindIII限制性内切酶
1
SOD基因/PET-32A质粒
8
无菌水
8
总体积20ul
上述反应体系,３7℃反应２h。
酶切产物的回收
酶切片段连接
在ＥP管中，加入如下反应体系
名称
体积（ul）
10× T4 DNA连接酶buffer
2
SOD基因酶切片段
5
PET-32A质粒酶切片段
5
T4 DNA连接酶
1
无菌水
7
总体积 20ul
１6℃
四.ＤH5α感受态制备及转化
感受态制备
ＬB培养基配制:称取１0ｇ 胰蛋白胨，５g酵母提取物,１0g ＮaCl,调节pＨ至7.２，定容至1L。高温高压灭菌。
转移0．1mｌ DH5α菌液于一只装有５－８ ml LB的试管中. 于37°C下,2５0rmp振荡培养2到2.５小时（检测OD６00,控制其在0.4－0．５之间)。
室温下，4０00 rpm离心5分钟收集对数期细胞。
弃培养基，保留细胞沉淀。
加入５毫升冰冷的ＣaCｌ2 溶液，并轻微打匀。
4°C下，400０ rpｍ离心1０分钟收集细胞。
加入0.5ml （每2５ ｍl初始培养物加入1ml)冰冷的0．１M的CaCl2 溶液,并轻微打匀。冰浴放置２0min。
此时的感受态细胞可直接进行转化操作,也可以分装,加入1/10体积的30%甘油后于-７0°C冰冻保藏。
转化
向事先灭菌,并经冷处理的1.5ml EP管中转移1０0ｕl感受态细胞悬浮液。向每个转化管中加入1０ul连接产物。细心混匀管中成份。于冰浴放置30到40分钟。
把转化管转移至放于42°C循环水浴锅中预热的试管架上,准确计时90秒。(此时不能摇动转化管）
把EＰ管迅速转移至冰浴２到3分钟。
随后向每个EＰ管中加入500ul LB培养基。3７°C 200rmp摇菌４5min，以使细菌复原，并容许质粒所编码的抗生素抗性的表达。
上述反应物4000rmp离心２min，吸弃部分培养基,使剩余体积不超过200ｕｌ，吹打混匀,随后涂布于含有ａｍp的LB-琼脂平板上。
37℃
于３7°C倒置平板培养。转化克隆应该于12-16 小时区间出现。
挑取单菌落,置于6 ml 含有amｐ的LB液体培养基中,３７℃ 250rmp摇菌培养8h。
五．SDS－PＡGE检测SOＤ蛋白的表达
取４ ml转化成功的菌液，加入1 ｍl蛋白上样缓冲液，1００℃ 裂解10min。
４℃
将玻璃板、样品梳冲洗干净,晾干,随后组装玻璃板。
按如下体积配制10%分离胶8 ml,混匀：
双蒸水
3.0ml
1.5M Tris-HCl pH8.8
2.1ml
30% Acr-Bis
2.8ml
10% SDS
100ul
10% AP
50ul
TEMED
5ul
向玻璃板间灌制分离胶,立即覆一层双蒸水，大约30miｎ后胶即可聚合。
按如下体积配制4%浓缩胶３.０ｍl，混匀：
将上层双蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶,插入样品梳。
装好电泳系统，加入点击缓冲液,上样1５ｕl。
调节电压至8０V,待溴酚蓝跑如分离胶时,调节电压至1２0Ｖ,电泳至溴酚蓝刚跑出分离胶。
卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色２ｈ,加入脱色液,置于摇床中，脱色。期间每３0mｉn更换一次脱色液，至完全脱净。
教师签名：
实验报告
SOD工程菌构建
目的：
了解ＰCR的原理和实验流程。了解质粒提取的原理和方法。了解酶切的原理和方法，单双酶切的区别，粘性末端连接和平端连接的差异。了解CaＣl２法制备大肠杆菌ＤH5α感受态及转化的原理。了解ＳDＳ检测蛋白质的原理和方法
二、原理：
工程菌是利用基因工程的方法，将外源基因导入到适当的受体细胞株中,使其得到高效表达。这种经改造后的细胞株称为工程菌。工程菌在基因工程药物、污染治理、生物能源能多方面具有重要作用。
SOＤ(超氧化物歧化酶）,是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。人体在不断地补充ＳOＤ后会具有抗衰老的特殊效果，被卫生部批准为具有药物功能的物质。因此,采用工程菌的原理和方法，体外大量合成SOD，有利于降低其生产成本,扩大使用范围。
三、实验材料与方法
1、实验材料与试剂:pＣM-T-SＯD质粒、Ｔａq ＤNA聚合酶、SOD特异性引物、dNＴPs ＰET-３2Ａ质粒、质粒提取试剂盒SOＤ基因(PCR回收产物)、ＰEＴ-32A质粒、EcoRV和ＨinｄIIＩ限制性内切酶大肠杆菌DH5α,１M预冷的CａCl2溶液，LB培养基，３０%甘油,氨苄青霉素转化成功的菌液，蛋白上样缓冲液,Tris-Ｈcl，10% SDＳ,ＴEMED，1０% AＰ（过硫酸铵),30% 丙烯酰胺单体（２9：１)
2、实验仪器:ＰＣＲ仪 水平凝胶电泳仪 摇床、超净工作台、离心机、干燥培养箱 垂直电泳系统、水浴锅
３、实验方法:
一．PCR扩增SOＤ基因及胶回收纯化
PCＲ扩增
胶回收ＰCR产物
1) 琼脂糖凝胶电泳检测PＣR产物，若得到目的条带可进行大批量PCR,回收目的片段；
2） 通过把切取含DNA片段的琼脂凝胶装在1.5 ｍL 小离心管中，称其重量近似地确定其体积，每100 mg琼脂凝胶相当于100 μＬ 体积。称量每次切取含DNA片段的琼脂糖凝胶加入等体积的溶液ＢD;
３) ５５～６5 ℃
4） 将溶液置于DNA纯化柱中，静置2 miｎ，１２000 ｒpm离心6０ s;
5) 加入5０0 μL 溶液PE于离心柱中，12000 ｒpｍ离心6０ ｓ,弃滤液;
６） 用溶液ＰE ５0０ μL 再洗一遍，120００ rpm离心60 ｓ，弃滤液；1２0０0 rｐｍ再次离心２ min，以甩干剩余液体;
7) 将离心柱置于新的离心管中，加入60 ℃预热的30~10０ μ
８） 重复步骤７；
9) 无菌水溶解DNA，贮存于-20 ℃
二．PEＴ-３2A质粒提取
1. 取过夜菌1.５毫升,5000ｇ离心１分钟收集细菌沉淀，弃上清。再重复一次,每管共收集3毫升过夜菌沉淀。
2． 每管加入2５0微升溶液I，重悬细菌沉淀。确保沉淀完全散开,无可见细菌团块。
3. 每管加入250微升溶液II,轻轻颠倒离心管4-6次,使细菌完全裂解,溶液透明。
4． 每管加入350微升溶液III,随即颠倒离心管4-６次混匀,可见白色絮状物产生。
5. 最高速(13，0０0rpm左右)室温离心10分钟。
６． 将上一步骤离心后的上清倒入或吸入到质粒纯化柱内。最高速离心３0-60秒，倒弃收集管内液体。
7. 在质粒纯化柱内加入７50微升溶液IV，最高速离心30-60秒，洗去杂质,倒弃收集管内液体。
８. 最高速再离心1分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。
9． 将质粒纯化柱置于1.５毫升离心管上，加入５０微升溶液V至管内柱面上,放置1分钟。
１0. 最高速离心1分钟，所得液体即为高纯度质粒。
11. 0.8％ TAE凝胶电泳检测质粒完整性。
三.酶切ＳOＤ基因和PET-32A质粒的双酶切及连接
SOD基因和PＥT-32A质粒的双酶切
在ＥP管中，加入如下双酶切体系
名称
加入体积（ul)
10× Buｆfer M
2
EcoRV限制性内切酶
１
HindIIＩ限制性内切酶
1
SOＤ基因/ＰET-32A质粒
８
无菌水
8
总体积２0ul
上述反应体系，37℃反应2h。
酶切产物的回收
四．ＤH5α感受态制备及转化
感受态制备
1.LＢ培养基配制：称取10ｇ 胰蛋白胨，5ｇ酵母提取物,1０g NaＣl,调节pH至7.2，定容至１L。高温高压灭菌。
2.转移0.1ml ＤH５α菌液于一只装有5－8 mｌ ＬB的试管中． 于３7°C下，2５0ｒｍｐ振荡培养2到2．5小时（检测ＯD600,控制其在0．4-0．5之间）。
3.室温下，4000 rｐm离心５分钟收集对数期细胞。
弃培养基,保留细胞沉淀。
4.加入5毫升冰冷的CaＣl2 溶液,并轻微打匀。
5.4°C下，40００ rpｍ离心１0分钟收集细胞。
6.加入０．5ml （每25 ｍl初始培养物加入1ｍl）冰冷的0.1Ｍ的CaCl２ 溶液，并轻微打匀。冰浴放置2０mｉｎ。7.此时的感受态细胞可直接进行转化操作,也可以分装,加入1／10体积的30％甘油后于-70°Ｃ冰冻保藏。
转化
向事先灭菌,并经冷处理的１．5ｍl ＥＰ管中转移100ul感受态细胞悬浮液。向每个转化管中加入１0ul连接产物。细心混匀管中成份。于冰浴放置30到40分钟。
把转化管转移至放于42°C循环水浴锅中预热的试管架上，准确计时90秒。（此时不能摇动转化管）
把EP管迅速转移至冰浴2到3分钟。
随后向每个EP管中加入５0０ul ＬB培养基。37°C ２00rmｐ摇菌４5mｉn,以使细菌复原，并容许质粒所编码的抗生素抗性的表达。
上述反应物４000rmp离心2min，吸弃部分培养基，使剩余体积不超过２0０ｕl，吹打混匀，随后涂布于含有ａmp的LB-琼脂平板上。
37℃
于37°C倒置平板培养。转化克隆应该于1２-16 小时区间出现。
挑取单菌落,置于6 ml 含有amp的LB液体培养基中，37℃ 2５0rmp摇菌培养8h。
五.ＳDＳ-PＡGE检测SOＤ蛋白的表达
1.取4 ml转化成功的菌液，加入1 ml蛋白上样缓冲液，100℃ 裂解10miｎ。
2.4℃,１20０0ｒｍp 离心5min,收集上清。
3.将玻璃板、样品梳冲洗干净,晾干,随后组装玻璃板。
4．按如下体积配制１0％分离胶8 ｍl,混匀:
５．向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层双蒸水,大约3０mｉn后胶即可聚合。
6.按如下体积配制４%浓缩胶3.0ｍl，混匀：
7.将上层双蒸水倾去,滤纸吸干,灌制浓缩胶,插入样品梳。
8.装好电泳系统，加入点击缓冲液,上样1５ul。
9.调节电压至８0V,待溴酚蓝跑如分离胶时，调节电压至120V,电泳至溴酚蓝刚跑出分离胶。
1０.卸下胶板,剥离胶放入染色液中,室温染色2h，加入脱色液，置于摇床中,脱色。期间每30min更换一次脱色液,至完全脱净。
四、实验结果与分析:
1. SOD基因和ＰET-３２A质粒的双酶切产物电泳图
2．SOD表达产物电泳图
３.转化平板图
４．PCR产物凝胶电泳图
分析:经过提取质粒、PCR扩增ＳOD基因、酶切连接SＯD基因和PＥＴ-3２A质粒、制备感受态及转化和SDS检测SOＤ蛋白的表达等过程，理论上来说是可以构建出含有ＳOD的工程菌，但实验最后菌落没有生长,应该是人为操作失误,可能是在接种时，未等接种环完全冷却就去接种,导致菌最后死亡。
五、结论
工程菌是用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系,是采用现代生物工程技术加工出来的新型微生物,具有多功能、高效和适应性强等特点,同时也在生产方面得到了大量的应用。本次实验通过学习最基本的SＯD工程菌的构建,从而让我们掌握了基因工程相关的基本操作和数据分析,。虽然本次实验最终没有得到相应的ＳOD工程菌,但是实验的过程才是最重要的。
参考文献：
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