大黄中大黄素的提取、分离和鉴定
一、实验目的熟悉蒽醌类成分的提取分离方法 2）掌握PH梯度提取法的原理和操作技术 3）掌握蒽醌类化合物鉴定方法 4）了解液液萃取法分离混合物的实验方法
二、实验原理
大黄为蓼科植物,味苦,性寒,具有泻热通肠、凉血解毒、逐瘀通经等功效。其主要有效成分为大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚等蒽醌类化合物 ,其中大部分为结合的蒽醌,少量为游离的蒽醌。结合的蒽醌类化合物由于其苷元具有酚羟基,故呈弱酸性,能溶于水、乙醇、碳酸氢钠溶液,但在有机溶剂中的溶解度很小。游离的蒽醌易溶于氯仿、乙醚等有机溶剂而不溶于水。其中，大黄酸具有羧基，酸性最强；大黄素具有β-酚羟基，酸性第二；芦荟大黄素连有羟甲基，酸性第三；大黄素甲醚和和大黄酚的酸性最弱。根据以上化合物的酸度差异，可用碱性强弱不同的溶液进行梯度萃取分离。
大黄酸 R1=H R2=COOH
大黄素 R1=CH3 R2=OH
芦荟大黄素 R1=CH2OH R2=H
大黄素甲醚 R1=CH3 R2=OCH3
大黄酚 R1=CH3 R2=H
本实验主要用薄层层析法分离纯化大黄素，其Rf值由大到小分别为大黄酚和大黄素甲醚、大黄素、芦荟大黄素、大黄酸。
三、实验器材
1)试药：大黄粗粉、20 %硫酸溶液、5 %碳酸氢钠溶液、5 %碳酸钠溶液、 盐酸、丙酮、乙酸乙酯、硅胶CMC-Na板、石油醚、大黄素标准品等
2)仪器： 250 ml烧杯X2、200 ml烧杯X2、100 ml烧杯X1、10 ml烧杯X3、250 ml分液漏斗X1、100 ml量筒X1、10 ml量筒X1、索氏提取器1套、中号铁圈X1、烧杯夹X1、250 ml上嘴抽滤瓶X1、8 cm布氏漏斗X1、药品匙X1、玻璃棒X1、胶头滴管X1、高方形染色缸X1、150 mm结晶皿X1、硅胶管X2、洗瓶X1、毛刷X1
四、实验操作
（一）酸水解
用天平称取大黄粉10g，置500ml烧杯中，加20%H2SO4水溶液100ml，直火加热1小时，用布氏漏斗抽滤，滤饼水洗后于70℃左右干燥。溶液沸腾时关闭电源，不沸腾时再打开，注意不要把溶液烧干，大黄粉从土黄色变为黑色。
总羟基蒽醌苷元的提取
（二）滤饼经干燥后，置索氏提取器中，加入乙醚150ml，回流提取2小时，得乙醚提取液。乙醚提取液经薄层色谱检查有大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄素甲醚和大黄酚。薄层板为硅胶CMC-Na板，展开剂为石油醚（沸程60~90℃）-乙酸乙酯（7:3），近水平或直立展开，在可见光下可看到四个斑点，Rf≈0.9的黄色斑点为大黄酚和大黄素甲醚混合物，在此条件下分不开，其余三个斑点，依Rf值由大到小分别为大黄素（橙色斑点）、芦荟大黄素（黄色斑点）、大黄酸（黄色斑点）。
（三）pH梯度萃取分离
大黄酸的分离和提纯：将上述乙醚提取液以5%碳酸氢钠溶液振荡提取，水层呈紫红色。分出水层，再重复提取数次，直至不显红色为止（共约60ml，分3~4次提取）。合并水层提取液，用盐酸酸化至pH3左右，即得黄色沉淀。过滤，先用水洗沉淀数次，再以少量冰冷的丙酮洗，以除去有色杂质。干燥后以冰醋酸或吡啶结晶2~3次，得黄色针状结晶。经熔点测定、纸色谱或薄层色谱，与标准品对照鉴定为大黄酸。
大黄素的分离和提纯：碳酸氢钠溶液提取后的乙醚层再以5%碳酸钠溶液振荡提取数次（共约120ml，分3~4次提取）水层呈红色，合并水层提取液，加盐酸至酸性（pH6左右），得黄色沉淀，过滤，用水洗沉淀，以冰冷丙酮洗，在冰醋酸或吡啶中结晶数次，得橙色大针状结晶。经熔点测定、纸色谱或薄层色谱，与标准品对照鉴定为大黄素。
芦荟大黄素的分离和提纯：碳酸钠溶液提取后的乙醚层，再经0.25%氢氧化钠溶液振荡提取数次（约100ml，分3~4次提取），水层呈红色，合并水层提取液，加盐酸至酸性（pH6左右），得橙色沉淀。过滤后用水洗沉淀，干燥后在冰醋酸或乙酸乙酯中结晶数次，得橙色长针状结晶。经熔点测定、纸色谱或薄层色谱鉴定为芦荟大黄素。
大黄酚和大黄素甲醚的分离和提纯：上述芦荟大黄素分离后的乙醚液用5%氢氧化钠溶液振荡提取数次，直至无色。合并深红色的水层溶液，加盐酸至酸性，得黄色沉淀。过滤，水洗，干燥后得大黄酚和大黄素甲醚混合物，将此混合物溶于乙酸乙酯，（可用硅胶薄层板，以石油醚：乙酸乙酯（15：1）作为展开剂展开，可见两斑点，Rf值大的为大黄酚，Rf值较小的为大黄素甲醚）用硅胶柱色谱分离，洗脱剂为石油醚（沸程60~90℃）-乙酸乙酯（15:1）混合物，先洗脱下的化合物为大黄酚，后洗脱下的化合物为大黄素甲醚，再分别经乙酸乙酯结晶纯化，两者经熔点测定、薄层色谱鉴定皆为纯品。
五、实验结果
根据各步骤得出的结果如下：
总羟基蒽醌苷元的提取：硅胶板在可见光下可看到四个斑点，黄色斑点为大黄酚和大黄素甲醚混合物，在此条件下分不开，其余三个斑点，依Rf值由大到小分别为大黄素（橙色斑点）、芦荟大黄素（黄色斑点）、大黄酸（黄色斑点）。
薄层色谱检查结果：
被分离物质 大黄酚和大黄素甲醚 大黄素 芦荟大黄素 大黄酸
比移值Rf 0.88 0.56 0.44 0.32
2）pH梯度萃取分离
1、黄色沉淀生成，该沉淀为大黄酸。
2、有黄色沉淀生成，该沉淀为大黄素。
3、有橙色沉淀生成，该沉淀为芦荟大黄素。
4、得黄色沉淀物，为大黄酚和大黄素甲醚。