成果详细介绍
综合介绍 随着人们生活节奏的加快和饮食结构的变化，罹患癌症的人群增多，对癌症的前期诊断和术后的监控尤为重要。前期研究发现 miR-196a-5p 和miR-125a-5p 在肺癌发生发展中起重要作用，它们的表达水平被应用于临床检验，有望成为肺癌早期诊断及区分肺癌不同分期的客观指标。基于海胆状金纳米粒子的表面增强拉曼散射技术（SERS）和侧向层析分析技术（GICA）的各自特点，我们通过结合 SERS 和侧向层析技术来建立一种新型的 miRNA 检测方法-SERS-GICA 技术。该方法充分发挥了 SERS 和 GICA 各自的优势，利用海胆状金纳米粒子的 SERS 技术可实现对病例样本中目标 miRNA 的高灵敏、定量化检测，减少主观因素的影响，有利于监测病人病情变化及治疗情况。GICA 中硝酸纤维（NC）膜不仅成本低、易操作、简便、快捷，而且 SERS 标记探针高度集中在约 150 m 宽的检测线（T 线），可采集到更为均匀的信号。本课题研究开展的重点工作，主要是：（1）基于海胆状金纳米粒子和金纳米多巴胺树脂（PDR@GNPs）复合微球构建“三明治”结构 SERS 传感器，对水溶液中 miR-196a-5p 进行定量检测。（2）制备多线多重 SERS-GICA 核酸试纸条，将其用于检测皮下异种肿瘤移植的小鼠肺癌发生发展阶段外周血中 miR-196a-5p 和miR-125a-5p 的表达变化。（3）为了进一步鉴定这两种 miRNA 作为肺癌标志物的潜力，基于多线多重 SERS-GICA 核酸试纸条检测 miR-196a-5p和 miR-125a-5p 在肺癌患者和健康人外周血、 尿液和痰液中的表达水平。
研究这两种 miRNA 在不同分期肺癌患者外周血、 尿液和痰液中表达情况，并分析两者之间的相关性。
（4）建立 SERS-GICA 单线多重检测 miRNA的方法，实现单线同时检测人肺癌细胞系中 miR-196a-5p 和 miR-125a-5p的表达水平。本研究拓展了 miRNA 检测方法，对实现肺癌早期诊断和病情监控具有重要意义。该试纸为肺癌早期诊疗做出贡献，同时也可以为其他疾病的检测提供通用平台。
1. 研究 目标 （1）制备形貌均一、单分散性好和表面增强拉曼散射（SERS）效应强的海胆状金纳米粒子（UGNs）。
（2）选择最优条件，制备形貌好且 SERS 效应强的金纳米多巴胺树脂（ PDR@GNPs ）
复 合 微 球 。
构 建 UGNs-SH probe-miRNA-T probe-PDR@GNPs“三明治”结构的 SERS 传感器，并将其用于检测溶液中 miRNA-196a-5p 的浓度。
（3）以海胆状金纳米粒子作为增强基底，构建多线多重和单线多重检测
miRNA 的表面增强拉曼散射侧向层析（SERS-GICA）核酸试纸条。建立快速、定量检测细胞、外周血、尿液和痰液中 miRNA 的新方法。
④ 探明在肺癌不同时期，肺癌患者外周血、尿液和痰液中 miRNA-196a-5p和 miRNA-125a-5p 表达水平的变化。
2. 研究内容 （1）采用种子介导生长法制备海胆状金纳米粒子。研究改变反应体系中反应物浓度和反应条件对产物的形貌、光学性质以及 SERS 效应的影响，从而提出最适合的合成条件。
（2）以多巴胺作为反应单体来制备多巴胺树脂（PDR）微球。接着将金纳米颗粒（GNPs）通过简单地原位吸附还原的方法成功地包裹在 PDR 微球的表面形成 PDR@GNPs 复合微球。研究不同浓度的氯金酸对PDR@GNPs 复合微球表面形貌的影响。优化条件，制备形貌好且 SERS效应强的 PDR@GNPs 复合微球。
（3）在海胆状金纳米粒子和 PDR@GNPs 复合微球的表面分别固定检测探针（SH probe）和捕获探针（T probe），待测物 miR-196a-5p 与 SH probe和 T Probe 部分杂交构建一种“三明治”结构的 SERS 传感器，用于检测不同浓度的 miR-196a-5p。
（4）在传统的侧向层析核酸试纸条的基础上，通过在试纸中间的硝酸纤维素膜（NC 膜）上的不同位置固定相应的捕获探针 T probe，即增加检测线（T 线）的数量，将海胆状金纳米粒子表面修饰拉曼信号分子对巯基苯甲酸（4-MBA）和检测探针 SH probe，利用“三明治”结构检测模型，构建多线多重检测肺癌患者外周血、尿液和痰液中 miR-196a-5p 和miR-125a-5p 的 SERS-GICA 核酸试纸条。根据试纸条中 T 线的位置可知待测 miRNA 的种类。通过不同 T 线处 4-MBA 特征峰的强度间接检测miRNA 的表达水平。研究在不同分期肺癌患者外周血、尿液和痰液中这两种 miRNA 表达水平的差异，分析它们的表达水平与病程进展的相关性。
（5）为了能够同时检测几种 miRNA，建立 SERS-GICA 单线多重检测miRNA 的方法。选择两种具有可区分特征峰的拉曼信号分子硫堇和尼罗蓝 A（NBA），标记到海胆状金纳米粒子的表面。在 NC 膜上设计一条质控线（C 线）和一条 T 线，而 T 线上同时固定捕获探针 T-196a-5p 和T-125a-5p 。根 据 拉 曼 特 征 峰 的 位 置 和 信 号 强 度 检 测 肺 癌 细 胞 中miR-196a-5p 和 miR-125a-5p 的种类和表达水平。
3. 研究方案 （1）海胆状金纳米粒子的制备和表征：采用种子介导生长法制备海胆状
金纳米粒子，首先合成金种子，然后以金种子为生长核，利用还原剂对苯二酚和柠檬酸钠还原氯金酸，以金种子作为生长位点，在金种子表面生长出多个枝角最终形成海胆状金纳米粒子。通过透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）、紫外-可见-近红外（UV-vis-NIR）分光光度计等表征海胆状金纳米粒子的形貌和光学性质。改变反应体系中反应物（包括金种用量、氯金酸与还原剂浓度配比）的比例和反应条件（包括 pH、反应温度、反应时间），调控海胆状金纳米粒子的 LSPR 峰的位置使 SERS信号最优化。制备形貌均一、单分散性好和 SERS 效应强的海胆状金纳米粒子。
（2）PDR@GNPs 复合微球的制备和表征：在不加模板和表面活性剂的条件下，通过凝胶-溶胶法制备 PDR 微球。在水和乙醇的反应溶液中，多巴胺生物分子和甲醛在氨水的催化作用下发生聚合反应，形成 PDR 微球。研究多巴胺生物分子的量对 PDR 微球形貌的影响。通过红外光谱和电子能谱证实 PDR 微球上含有丰富的化学活性基团（如氨基、羟基、羧基和羰基等），为后续在 PDR 微球上修饰金属纳米颗粒、信号分子和碱基序列等打下基础（前期工作基础部分图 7E）。将 PDR 微球分散到含有氯金酸的溶液中搅拌一定的时间，带正电荷的金离子通过静电吸引作用被修饰到树脂微球表面。在还原剂存在的条件下，金离子被还原成金纳米颗粒吸附在树脂微球上。研究不同浓度的氯金酸对 PDR 微球上金纳米颗粒形貌的影响。通过 TEM、SEM 和共聚焦拉曼光谱仪研究 PDR@GNPs 复合微球的形貌和 SERS 活性。选取最适浓度的氯金酸，用于制备形貌好且 SERS 效应强的 PDR@GNPs 复合微球。
（3）基于 UGNs-SH probe-miRNA-T probe-PDR@GNPs“三明治”结构SERS 传感器检测 miR-196a-5p：在制备海胆状金纳米粒子和 PDR@GNPs复合微球的基础上，首先在海胆状金纳米粒子表面修饰拉曼信号分子4-MBA 后再在其表面固定检测探针 SH-probe，接着捕获探针 NH 2 -T-probe可以通过氨基与复合微球表面羧基发生缩合反应而固定 T-probe。利用miRNA 与检测探针、捕获探针杂交形成“三明治”结构复合体，如图 1所示。将 miR-196a-5p 溶解在双蒸水中，制成不同浓度的 miR-196a-5p 溶液。通过 SERS 检测 miR-196a-5p。当待测 miR-196a-5p 浓度越大，T-probe功能化的 PDR@GNPs 复合微球捕获的 SERS 探针的数目越多，从而可通过 SERS 信号的强弱来间接检测 miR-196a-5p 的浓度。得到 SERS 传感器的相应检测指标，包括检测灵敏度及线性范围。
图 1 “三明治”结构 SERS 传感器的构建及其用于检测 miR-196a-5p 的示意图。
（4）基于多线多重 SERS-GICA 核酸试纸条检测肺癌患者外周血、尿液和痰液中两种 miRNA：如图 2 所示，以 miR-196a-5p 和 miR-125a-5p 为检测对象，在 NC 膜上的不同位置分别固定质控线（C 线）捕获探针 C probe，以及与两种 miRNA 相对应的 T 线捕获探针 T-196a-5p 和 T-125a-5p，其中T 线捕获探针的一端可与对应的目标 miRNA 部分碱基互补配对。接着在海胆状金纳米粒子上标记 4-MBA，并分别修饰了两种不同的检测探针SH-196a-5p 和 SH-125a-5p，形成金标复合物并将其滴涂在金标垫上，两种检测探针的一端也可与其相应的目标 miRNA 另一端进行碱基互补配对。具体步骤：合成目标 miRNA 和其它核酸探针（表 1）。利用点膜仪将T-196a-5p 和 T-125a-5p 包被于 NC 膜的 T 线上，C 线捕获探针包被于 NC膜的质控线上，干燥至完全，使其牢固的吸附在硝酸纤维素膜上。使用微量注射器将海胆状金纳米粒子标记的 SH-196a-5p 和 SH-125a-5p 滴加在金标垫上，干燥至完全。检测时，将样品溶液滴加到样品垫上，当待测样品中有目标 miRNA 存在时，随着样品在试纸条上迁移，miRNA 先与金标垫上的金标复合物中检测探针进行部分杂交，随着样品带动金标复合物在NC 膜上继续迁移，待测样品中的 miRNA 又会与相应的 T probe 部分杂交，形成“三明治”结构，从而将海胆状金纳米粒子捕获并滞留在相应的检测线位置。当待测样品中目标 miRNA 达到一定浓度时，被捕获的海胆状金纳米粒子的量也就越多，显线的颜色越强，即可观察到红色条带。如果待测样品中不含目标 miRNA，则无法形成上述的“三明治”夹心结构，金纳米粒子也就无法在检测线上滞留聚集，因此无法在检测区域观察到红色条带。当样品中含有 miR-196a-5p 和 miR-125a-5p 中的任意一种时，则会在对应的检测线位置出现红色条带，即可观察到 C 线和一条 T 线。观察 T线的出现位置，可以判断目标 miRNA 的种类，但是无法辨别目标 miRNA
的浓度。因此，通过共聚焦拉曼仪检测不同位置的 T 线，根据拉曼信号分子特征峰的强度测得样品中 miR-196a-5p 和 miR-125a-5p 的浓度。
在 SERS-GICA 核酸试纸条的制备过程中，需要对一些条件进行处理和优化。（1）样品垫和金标垫需要进行预处理，使其具有更好的表面活性和亲水性，增强了样品在其中的分散性，有利于释放。（2）选取不同种类NC 膜进行对比实验。选择孔径合适、层析能力好的 NC 膜，使待测样品在 NC 膜上更快速的流动。（3）SH probe 的浓度和用量是实验可行性的关键因素，选择不同浓度的 SH probe 进行了对比和优化。（4）通过 miRNA单碱基错配、两个碱基错配、随机序列分别进行特异性测试，通过 SERS及 PCR 分别检测待测 miRNA，验证核酸试纸条的特异性和准确性，排除可能出现假阴性或者假阳性。
图 2 多线双重 SERS-GICA 核酸试纸条的构建及其对肺癌患者外周血、尿液和痰液中 miR-196a-5p 和 miR-125a-5p 检测的原理图。
收集适龄健康患者 200 例（来源：扬州大学附属医院），肺癌患者 200例（来源：扬州大学临床医院胸外科），实验分组：A 组：健康组；B 组：肺癌患者组。对患者情况，如年龄、体重、性别进行校对。将收集的外周血、尿液和痰液样本滴到 SERS-GICA 核酸试纸条上。通过 SERS 对比各组体液样本中两种 miRNA 的表达水平差异。数据采用 SPSS19.0 软件包进行统计分析，miRNA-196a-5p 和 miRNA-125a-5p 在肺癌不同时期的表达水平采用 2 和检验进行单因素分析，随后采用 logistic 回归进行多因素分析。正常组和肺癌组之间 miRNA-196a-5p 和 miRNA-125a-5p 差异性分析采用检验及 2 检验。miRNA-196a-5p、miRNA-125a-5p 与肺癌关系采用 logistic回归进行分析。通过绘制 ROC 曲线判断 miRNA-196a-5 和 miRNA-125a-5p诊断早期肺癌的临界值及预测价值，P<0.05 为差异有统计学意义。
⑤ 基于单线多重 SERS-GICA 核酸试纸检测肺癌细胞中两种 miRNA：上一部分根据不同位置 T 线处拉曼信号的强度，得到两个 miRNA 的表达水平。为了能够更加快速、高灵敏、定量的同时检测 miR-196a-5p 和miR-125a-5p，设计单线多重 miRNA 检测技术。选择两种具有可区分特征
峰的拉曼信号分子硫堇和 NBA，标记到海胆状金纳米粒子的表面，同时在海胆状金纳米粒子上通过银巯键分别修饰上 SH-196a-5p 和 SH-125a-5p两种检测探针，形成两种拉曼标记复合物后混合并滴涂在结合垫上。检测探针的一段可与相应的目标 miRNA 的一部分进行碱基互补配对。在 NC膜上设计一条质控线和一条检测线，而检测线上同时固定捕获探针T-196a-5p 和 T-125a-5p，其中 T probe 的一端可与对应的目标物 miRNA 另一部分碱基互补配对。利用显微共聚焦拉曼仪检测 T 线位置拉曼信号分子的信号。由于目标物浓度不同，被捕获的纳米粒子的量不同，所以产生的拉曼信号强度也有区别；且检测探针 SH-196a-5p 和 SH-125a-5p 所对应的拉曼信号分子不同，因此产生的拉曼特征峰不同，硫堇和 NBA 的特征峰分别位于 592 cm -1 和 1420 cm -1 处。根据不同信号分子拉曼特征峰的位置和拉曼信号强度可以得知待测样品中 miRNA 的种类和浓度。通过 SERS检将肺癌细胞裂解并把裂解物滴加到试纸上，检测肺癌细胞中 miRNA 的表达水平（图 3）。使用 PCR 验证 SERS-GICA 技术的特异性和准确性。
图 3 基于单线双重 SERS-GICA 核酸试纸条检测肺癌细胞中 miR-196a-5p和 miR-125a-5p 的表达水平的原理图。
表 1 核酸探针序列 名称 探针序列
miR-196a-5p
5′-UAGUAAGUUUCACUGUGAUUCGGG-3′ miR-125a-5p
5′-UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGA-3′
C probe
5′-ACACGGTGTCTAGGGGG-3′
T-196a-5p
5′-TGAAACTTACTACCCCC-3′ T-125a-5p
5′-GGGTCTCAGGGACCCCC-3′ SH-196a-5p
5′-thiol-CCCCCTAGACACCGTGTCCCGAATCACAG-3′
SH-125a-5p
5′-thiol-CCCCCTAGACACCGTGTTCACAGGTTAAA-3′
创新要点 （1）在不添加表面活性剂的条件下，优化反应条件，采用种子介导生长法制备既空间不对称又具有尖锐边缘或枝角的海胆状新型金纳米结构。发展一种简单、快速、产率高制备海胆状金纳米粒子的方法。
（2）发展一种快速、灵敏、高效、低廉的检测 miRNA 的新方法。基于海胆状金纳米粒子构建多线多重和单线多重 SERS-GICA 核酸试纸条，用于miRNA-196a-5p、miRNA-125a-5p 的检测。在病例样本中目标 miRNA 较低的情况下，充分发挥SERS技术和GICA技术各自的优势，能够将miRNA的最低检测限显著性提高，并快速和定量测得样本中 miRNA 的表达水平，这对实现 miRNA 的临床检测具有重要意义。
（3）既往对肺癌的研究多数集中于对 CEA、NSE、CK-19 等蛋白质类相关指标的检测，以 miRNA 作为肿瘤标志物更具灵敏性和特异性。直接以外周血、尿液和痰液作为生物检测样本，具有取材方便、操作步骤简单、无创伤性和可连续体外检测等优点。
（4）我们从技术上率先使用 SERS-GICA 技术检测外周血、尿液和痰液中miRNA-196a-5p、miRNA-125a-5p 的表达水平，试图揭示这两种 miRNA在推动肺癌病程进展中的作用及功能，对肺癌早期诊断、预后、病情监测和治疗具有重要意义。
技术指标 （1）
使用 qRT-PCR 法对 A549 细胞和 BEAS-2B 细胞中 miRNA-196a-5p表达水平检测，结果显示，A549 细胞中的 miRNA-196a-5p 表达水平明显高于 BEAS-2B 细胞（图 4A）。使用 qRT-PCR 法对新鲜肺癌组织及癌旁组织中 miRNA-196a-5p 和 miRNA-125a-5p 表达水平检测，结果显示，肺癌组织中的 miRNA-196a-5p 表达水平明显高于癌旁组织（图 4B），而肺癌组织中的 miRNA-125a-5p 表达水平明显低于癌旁组织（图 4C）。
图 4（A）A549 细胞和 BEAS-2B 细胞中 miRNA-196a-5p 表达水平。肺癌组织及癌旁组织中（B）miRNA-196a-5p、（C）miRNA-125a-5p 表达水平。
（2）通过 SEM 和 TEM 表征了海胆状金纳米粒子的形貌和结构，如图 5A和图 5B 所示。海胆状金纳米粒子的形貌均一、单分散性好。每个海胆状金纳米粒子粒径约 70 nm，由一个 50 nm 的中心核及 6-10 个 10 nm 的纳米枝角构成。海胆状金纳米粒子表面的纳米枝角使得单个纳米粒子上同时具有多个“热点”，这将显著增强其 SERS 效应。图 5C 是海胆状金纳米粒子的高分辨透射电镜（HRTEM），纳米粒子表面的纳米枝角具有一致的晶格取向，因而为单晶结构。清晰的晶格条纹表明产物具有良好的结晶性和纯度，其中晶格间距 d=0.24 nm 对应 Au 的(111)晶面。选区电子衍射（SAED）图谱中明亮的衍射点也表明产物为单晶，衍射斑点的 d 值为 0.275 nm，0.24 nm，0.144 nm 和 0.123 nm，分别对应于 Au 的(311)、(111)、(022)和(123)面的晶面（图 5D）。图 5E 显示海胆状金纳米粒子溶液的颜色蓝绿色，LSPR吸收峰位于650 nm处。图5F是海胆状金纳米粒子作为增强基底测得的10 -7
M 4-MBA 的 SERS 光谱。计算得到的海胆状金纳米粒子的拉曼增强因子（EF）为 7.5×10 5 ，远高于金纳米球的 EF（0.8×10 4 ）。
图 5 海胆状金纳米粒子的（A）SEM 照片、（B）TEM 照片、（C）HRTEM照片和相应 SAED 图。（E）海胆状金纳米粒子的紫外可见吸收光谱和溶液照片。（F）4-MBA和 4-MBA标记的海胆状金纳米粒子的 SERS光谱。
（3）在滴加含有不同浓度 miR-125a-5p 的样品溶液后（1 mM、10 nM、1 nM、0.1 nM、10 pM、1 pM、0.1 pM、10 fM），SERS 试纸检测线和质控线的显色结果如图 6A 所示。从光学照片可以看出，这种纳米颗粒所制作的试剂盒最低检测限均为 1 nM。通过 SERS 特性评价实验，滴加含有不同浓度 miR-125a-5p 的样品溶液，待其检测线和质控线的显色干燥后，利用拉曼光谱仪采集检测线上拉曼分子的光谱，每个条带分别随机取 5 个不同点测量，检测结果如图 6B 所示。选取 4-MBA 分子位于 1077 cm -1 处的特征峰强度作为比较的标准。拉曼光谱强度随样品中 miR-125a-5p 浓度的增加而增强。图 6C 是 1077 cm -1 处特征峰的拉曼强度与 miR-125a-5p 浓度对数值的关系图。4-MBA 在 1077 cm −1 处特征峰的拉曼强度与 miR-125a-5p浓度的对数值呈现一定的线性关系，线性方程为 Y=10852X+98760，线性相关系数为 R=0.95。因此，我们可以利用 4-MBA 在 1077 cm −1 处的特征峰和其浓度对数值的线性关系来定量地分析检测一定浓度范围内的miR-125a-5p。基于光学或肉眼的 miR-125a-5p 侧向层析检测方法的检测范围为＞1 nM，基于拉曼的 miR-125a-5p 侧向层析检测方法的检测范围为＞10 fM。
图 6（A）海胆状金纳米粒子制作的试剂盒对 miR-125a-5p 的检测结果（光学照片）。
（B）SERS 对不同浓度 miR-125a-5p 的检测结果。
（C）miR-125a-5p的浓度与 SERS 强度的线性关系。