基因工程的教学设计
界首中学 郑学胜
教学目标
一、知识与技能
1、基因工程的概念和基本工具
2、基因操作基本步骤
3、基因工程应用
二、过程与方法
1、通过对视频、图片等的观察，学会观察方法，培养观察能力。
2、通过对基本概念、基本原理、科学方法的正确理解和掌握，逐步形成比较、判断、推理、分析、综合等思维能力，具备能运用学到的生物学知识评价和解决某些实际问题的能力。
3、通过对基因操作基本步骤的学习，使学生在理解步骤的同时，举一反三，对于其他基因工程操作实例做到能理解、能介绍，从而培养学生对相关知识的理解能力及良好的语言表达能力。
三、情感态度与价值观
1、通过学习基因操作的工具和基本步骤，形成结构与功能相统一的基本点。
2、通过学习了解基因工程的应用，培养理论联系实际的良好学习习惯。
3、能利用课本以外的资料和信息解决课内学习中发现的问题，从而培养学生自主学习能力，为终身学习、后续学习打下坚实的基础。
四、教学重点
1、基因操作的工具和基本步骤。
2、基因工程在医药卫生方面的重要作用及基因工程在农牧业方面取得的成果及前景。
五、教学难点
限制性内切酶和运载体的作用及提取目的基因的方法
六、教学方法
应用PPT的视频、图片和文字相结合讲授新课 教学过程 师:上课! 生:老师好! 师:同学好!请坐下。
师:首先请同学们阅读大屏幕的资料 师:现在请仔细观看视频，思考相关问题。
师:[提问]：好,通过观看视频和阅读相关资料 师:你有什么样的启示或构想呢? 师:请同学们思考一下。
师:想一想,哪位同学愿意先谈一谈,请？
生：是不是,可以借助噬菌体培养出能合成胰岛素的大肠杆菌呢？ 师：回答的非常很好
师：我们可以利用这个原理就有可能培养出能合成人胰岛素的大肠杆菌！ 师：谈谈你为什么会这样的构想呢？
生：通过视频我们可以发现噬菌体能在大肠杆菌细胞内合成构成它的蛋白质外壳，生：如果将我们的DNA分子中胰岛素基因提取出来，
生：将其整合到噬菌体的DNA分子上导入大肠杆菌细胞中,有可能培养出能合成胰岛素的大肠杆菌。
师：好,这位同学的想法非常好！
我们可以借助噬菌体DNA将人的胰岛素基因导入到人的大肠杆菌细胞,利用大肠杆菌细胞内原料、酶、能量等,不就有可能培养出能合成胰岛素的大肠杆菌! 请同学们再思考一下,如果要实现这一构想关键步骤是什么呢？ 那同学愿意回答一下，请举手。
生：如何将胰岛素基因从人体细胞内提取出来？如何将胰岛素基因与噬菌体DNA分子连接起来? 师：好，回答的很好，请在家想一想我们要实现这一构想必须要考虑以下三个方面的问题：
1、如何将胰岛素基因从DNA分子中内提取出来？
2、如何将胰岛素基因与噬菌体DNA分子整合起来呢?
3、噬菌体会伤害大肠杆菌，如何解决这一问题呢？有没有其它更好的工具代替呢？
师：请同学翻开教材阅读102，我们就一起学习第6章第二次《基因工程及其应用》，并思考以下问题：
1、什么叫基因工程?
2、基因工程的基本操作步骤有哪些? 师：什么是基因工程，哪一同学愿意先讲一讲？ 生：基因工程又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。
通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。
师：回答的很好，请坐下！
大家都知道DNA分子很小，可是如何才能修饰改造DNA分子呢？
其实大自然早为我们准备好工具。现在我们一起学习基因的“剪刀”——限制性核酸内切酶（边演示边讲解）。
限制性核酸内切酶，简称限制酶，主要分布在微生物体内。
它是基因工程中重要的切割工具，并且在微生物体内能将外来的DNA分子切断，但对自己的DNA分子无损害。
那么它如何切割DNA分子的呢？
请大家注意看（请同学帮忙演示，教师讲解）：这是DNA分子的双螺旋结构，外侧是磷酸与脱氧核糠交替构成DNA分子的基本支架，限制酶裂解磷酸二酯键，产生这样结构的DNA分子。
请注意：这是一段单链DNA片段，我们称之为黏性末端。
也就是说，限制酶裂解磷酸二酯键，产生具有黏性末端DNA分子。
同其它酶一样限制酶也具有专一性即每一种限制酶只能识别特定核苷酸序列，在特定的切点切割DNA分子。
请同学看一个实例：大肠杆菌细胞中的有一种限制酶(EcoRⅠ)能识别 GAATTC序列，并在G和A之间切开。
（演示）图中的DNA分子片段中有 GAATTC序列，加入该限制酶先识别该序列，然后在G和A之间切开，就会形成两个具有黏性末端的DNA片段，如图所示。
师：限制酶可以切割DNA分子，有没有可以将DNA分子连接起来的“针线”呢？当然有,将DNA片段连接起的“针线”就是DNA连接酶。
DNA连接酶的作用是将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子，在连接的部位生成磷酸二酯键。
请大家看大屏幕——DNA连接酶的作用过程。
师：用限制酶和DNA连接酶可以获得重组DNA分子。
为让大家更的好理解，请同学按大屏幕的要求和课前准备的工具构建重组DNA分子模型。
请按小组进行。
师：哪个小组的同学愿意展示构建好的重组DNA分子模型？ 做的非常好！
请同学看大屏幕（演示）。将2个不同的，但含有相同序列的DNA分子用同一种限制酶进行切割后会产生具有相同黏性末端的DNA分子片段，然后将它们放在一起用DNA连接酶就能将其连接，形成重组DNA分子。
师：现在我们思考一下第三的问题，用限制酶和DNA连接酶可以将胰岛素基因与噬菌体DNA分子整合在一起，但噬菌体会伤害大肠杆菌，怎么办？
其实可以运输目的基因的工具有许多种，统称为运载体。
常用的运载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等。
其中质粒是最常的运载体，质粒存在于许多细菌和酵母菌等生物中,是细胞内能够独立、自主复制、很小的环状DNA分子。
请同学看图：大肠杆菌细胞中就含有许多质粒，质粒上具有很多的基因，特别一些抗性基因，在基因工程操作中具有很重要的作用。（等一会我们再学习。）
师：请大家思考一下如果要作为运载体至少具备什么样的条件呢？ 同学们回答的很好，现在我们一起总结一下：
1、能够在宿主细胞内复制并稳定保存；
2、具有多个限制酶切点以便与外源（目的）基因相连；
3、具有标记基因，便于进行筛选。刚刚我们提到的抗性基因就可以作为标记基因。（比如：）在普通培养基加入青莓素，普通大肠杆菌不能存活，而导入具有抗青莓素抗性基因质粒的大肠杆菌却可以含有青莓素的培养基中存活、繁殖，就可以筛选出成功导入重组质粒的大肠杆菌了，在以后的学习我们会深入的了解相关的知识。
刚刚讲到质粒是最常的运载体，为什么呢？ 就是因为质粒对受体细胞没伤害。
师：现在基因工程操作所需要的基本工具都有了，那么基因工程操作步骤是怎样的呢？ 请同学阅读教材103,等一会请同学回答。
师：有没有不同意见，如果没有请同学们一起回答：
1、提取目的基因
2、目的基因与运载体结合
3、将目的基因导入受体细胞
4、目的基因的检测和表达
师：请同学们看基因工程操作的基本步骤示意图，思考填空。（演示） 师：那同学愿意回答，请举手。
生1：取出含有目的基因的DNA分子，用一定的限制性核酸内切酶进行切割，使其出现黏性末端切口。
用同一种限制性核酸内切酶切断质粒，使其产生相同黏性末端。
将下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分了（重组质粒）。
师：回答的很好！请同学们注意！ 必须用同一种限制酶切，得到具有相同黏性末端的DNA片段，才用DNA连接酶连接从而得到重组质粒。关
天基因工程的第
三、第四步——将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测和表达。 详见生物选修3专题1基因工程，请同学们课后先自学。
师：实现构想——归纳培养能合成人胰岛素大肠杆菌的基本思路！哪位同学愿意谈谈？
生：将人的胰岛素基因提取出来并整合到质粒上，形成重组质粒，然后将重组质粒导入到大肠杆菌的细胞中就可以培养出能合成胰岛素的大肠杆菌了。
师：回答的很好！
通过基因工程培养出来的能合成胰岛素的大肠杆菌称为转基因大肠杆菌， 以后，我们将由基因工程培养出来的生物统称为转因生物。
现在转基因生物越来越多！
请大家阅读教材104——基因工程的应用。
师：现在我们一起来简单的了解一下基因工程的应用。
1、基因工程与农作物育种
用基因工程技术将抗病、抗虫、抗旱等优良基因导入性农作物细胞中，就可以培育一些具有优良性状的农作物品种，例如：抗虫棉等。
2、基因工程与药物研制。
微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。
若将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。
例如：利用转基因大肠杆菌合成胰岛素。
3、基因工程在环境保护方面应用也很多。
比如：利用基因工程培育的“指示生物”能十分灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物。
师：有关基因工程的应用我们简单了解一下，详见生物选修3专题1基因工程，请同学们课后先自学。
请下面我们做一道练习，请看大屏幕。
例1：基因工程技术在培育抗旱植物用于发展沙漠农业和改造沙漠方面显示了良好的前景,荷兰一家公司将大肠杆菌中的海藻糖合成酶基因导入植物(如甜菜、马铃薯等)中并获得有效表达，使“工程植物”增强了耐旱性、耐寒性的基本操作步骤是。
师：哪位同学愿意到黑板上将正确答案写出来？（请几位同学到黑板）。
生1：海藻糖合成酶基因的获取，目的基因与运载体结合，将目的基因导入受体细胞，目的基因的表达和检测。
生2：基因通过转录、翻译合成蛋白质，体现出相应的性状 生3：酶基因转录生成mRNA翻译合成海藻糖合成酶。
师：我们一起看他们书写的答案，正确吗？（边看边讲解）。
师：同学们，通过学习我们了解了基因工程的基本知识，科学一把双刃剑,基因工程培养出来的生物对有人类来说是有利还有害呢?请同学们看课外作业：调查各类转基因食品，并讨论转基因食品的安全性,撰写一篇小论文。
师：下课 ！
《基因工程的应用》教学设计
教学目标
1.举例说出基因工程应用及取得的丰硕成果。 2.关注基因工程的进展。
3.认同基因工程的应用促进生产力的提高。 教学重难点 1.教学重点
基因工程在农业和医疗等方面的应用。
2.教学难点 基因治疗。
教学工具 多媒体 教学过程
（一） 上一节课我们介绍了基因工程，先复习一下什么是基因工程？
基因工程就是按照人类的要求，把基因从生物体内提取出来在体外进行操作和加工，然后再把它导入一个新生物体；
使其遗传结构发生改变，产生我们所需要的新品种。
这种生物我们可以称为转基因生物。世界上第一种转基因植物是1983年品质培植成功的，具有抗生素药物的烟草；
那么第一种转基因动物是什么呢？ 师：〈投影片转基因鼠〉
这两只小老鼠大家是否熟悉，请看一下教科书的封面。
这就是世界上第一只转基因动物。
是1982年诞生的！美国科学家把一种大鼠的生长激素基因转移到一种小鼠的受精卵 中，然后培植成功了一种转基因鼠、它的生长速度要比一般老鼠快50%，大1.8倍， 这种基因现在已经转移给它的下一代了。随着基因技术的发展，我们说转基因生物现 在已经到各处都有了，在工农业生产中都有广泛的应用。下面每个学习小组把查找到 的相关资料给大家介绍一下，有关图片已存入电脑由我来控制，放映到哪张图片，请 这一组的同学解答。
师：（放投影片）
下面我们看一下屏幕上的这只牛。
1 大家现在所看到的这头不是一般的牛，它有两个地方比较特殊：一个是它来之不易，芬兰科学家通过1~3次实验才把它培育出来的。这头牛所挤出的奶牛含有促红细胞素，也就是它能帮助人生成红细胞，而这种药品在世界上是比较昂贵的所以说有了这头牛，只要喝它的牛奶就能治疗某些缺少红细胞的疾病，所以这头牛也由此成了世界上最昂贵的牛。
第一个上市转基因工程产品——不腐烂的番茄，在果实的成熟过程中它是直接受控于呼吸作用。那么我们可以根据呼吸作用发展的趁势，分为两类：一类是越变形果实；
一类是非越变形果实。我们知道越变形果实在成熟过程中，会出现明显的呼吸高峰。而非越变形果实则没有这样的高峰，于是就产生了一个问题。越变形果实它在成熟中因为它的呼吸作用往往是突然的又无法控制。所以常常造成巨大的经济摸失。传统的技术往往是通过乙烯催熟在还没有成熟时就把它采摘下来，然后在出售时用乙烯催熟，虽然这样有它的好处，但实际上不能真正起到保鲜作用。所以我们需要找到一条更好的方法来对果实进行保鲜。科学家们通过研究发现了这样一个过程。
S—腺苷酰丝氨酸（ACC合成酶）1—氨基环丙烷—1—羧酸（乙烯合成酶） 乙烯
我在黑板上写出来的就是科学家们发现的乙烯（ACC）合成过程，从这个过程上我们可以看到ACL是乙烯合成的直接前体，而ACL又直接受控于ACL合成酶，那么我们知道ACL合成酶是通过植物体内的RNA转译形成的产物，那么我们就可以通过降低RNA的含量来间接地降低乙烯的含量。科学家的进一步研究发现这样的方法是可行的。那就是反义RNA技术，反义RNA技术就是通过向细胞内补充与mRNA互补的RNA，然后使它与mRNA形成双链达到很不稳定的结构。从而容易降解，通过这样的方法，科学家就对番茄进行了实验。那么也就是说我们找到了一条比较可行而且经济的途径来真正对水果进行保鲜，也许在不久的将来大家的餐桌上会出现这样一些转基因番茄。我们有理由坚信，转基因技术在将来有进一步的发展 所谓转基因技术就是把外源基因转移到动、植物基因组中去。1997年经各组织的统计结果显示：在申请环境释放的实验报告中，98.25%为转基因
植物，而在这些转基因植物中80%左右都是抗病虫和抗除草剂的作物。如1996年以来美国研究人员一直种植一种转基因改良棉花，这种棉花含有一种从细菌中提取的对棉铃虫有致命作用的基因。目前科学家还在创造含天然杀虫剂基因的玉米和马铃薯。而在中国，在科技部国家生物工程研究开发中心863项目支持下，中国农科院生物技术研究中心，根据植物偏爱的密码子成功合成了B2B，并转入了适合我国生态条件的棉花品种获得了高抗棉铃虫的转基因植物，成为了美国之后世界上第二个拥有转gene抗虫棉的国家，现已获得农业生物gene工程安全生产委员会批准商品化生产。1998年在安徽、陕西、湖南等地试种15万亩，估计
2 在2000年可达到500万亩左右。
由于基因工程在农业上具有极大的经济价值，各国政府都非常重视。美国的一些基因工程公司特别重视基因工程作物的种植。1999年，全球有了200万公顷的基因工程作物，其中美国大约占了2000万公顷。在美国的超市里60%的加工食品里含有转基因成分，但在欧洲好像不是这种情况。大家看一下这张照片。世界绿色和平组织在希腊雅典的一个加工转基因食品的工厂外面，悬挂标语牌：gene危险。
课后小结
第一，可能表现在一些转基因食品有毒，一些科学家认为对 基因进行人工提取时，当人们达到了某些目的后，同时也增加了其微量的毒素，而这 些微量毒素的累计也可能对人体有害，第二，过敏性问题，一些人本来对某些食品过 敏，但是他吃了转基因食品之后，对本来不过敏的食品，也过敏了，其原因就是食品 中的蛋白质发生了转移，比如科学家将玉米的基因转入小麦中，那么对玉米过敏的人 吃了这种小麦后也会过敏。
课后习题
1、切取某动物合成生长激素的基因，用某种方法将此基因转移到鲇鱼的受精卵中，从而鲇鱼比同类个体大3～4倍，此项研究遵循的原理是( ) A．基因突变，DNA→RNA→蛋白质 B．基因工程，DNA→tRNA→蛋白质 C．细胞工程，DNA→RNA→蛋白质 D．基因重组，DNA→RNA→蛋白质
2、上海医学遗传研究所成功培育出第一头携带人白蛋白基因的转基因牛。他们还研究出一种可大大提高基因表达水平的新方法，使转基因动物乳汁中的白蛋白提高了30多倍，这标志着我国转基因研究向产业化的目标迈进了一步。那么“转基因动物”是指( ) A．提供基因的动物 B．基因组成中转人了外源基因的动物 C．能产生白蛋白的动物 D．能表达基因遗传信息的动物 3．下列各项不属于基因工程在实际中的应用的是( ) A．转基因抗虫棉的培育成功 B．利用DNA探针检测饮用水中有无病毒
C．培育工程菌使之能产生胰岛素 D．将C4植物细胞内的叶绿体移入C3植物细胞内 4．有关基因工程的成果及应用的说法正确的是( ) A．用基因工程方法培育的抗虫植物也能抗病毒
B．基因工程在畜牧业上应用的主要目的是培养体型巨大、品质优良的动物
C．基因工程在农业上的应用主要是培育高产、稳产、品质优良和具有抗逆性的农作物 D．目前，在发达国家，基因治疗已用于临床实践
5、运用现代生物技术的育种方法，将抗菜青虫的Bt基因转移到优质油菜中，培育出转基因抗虫的油菜品种，这一品种在生长过程中能产生特异的杀虫蛋白，对菜青虫有显著抗性，能大大减轻菜青虫对油菜的危害，提高油菜产量，减少农药使用，保护农业生态环境。根据以上信息，下列叙述正确的是（ ）
A、Bt基因的化学成分是蛋白质 B、Bt基因中有菜青虫的遗传物质 C、转基因抗虫油菜能产生杀虫蛋白是由于具有Bt基因 D、转基因抗虫油菜产生的杀虫蛋白是无机物 参考答案：DBDCC 板书 3.1基因工程的应用
一、基因工程的应用
二、转基因蚊子
三、转基因番茄
四、S—腺苷酰丝氨酸（ACC合成酶）1—氨基环丙烷—1—羧酸（乙烯合成酶）
五、转基因技术
乙烯
RNA干扰研究进展
摘要 ：RNA干扰（RNAi）是广泛存在于真菌、动物、植物的一种自身调控机制，是双链RNA诱发的使同源mRNA高效特异性降解的基因沉默现象，也是近几年生命科学的研究热点，具有广泛的应用前景。本文主要介绍了RNAi的发现、作用机理和在各个领域的应用。
关键词：
RNAi；
dsRNA；
siRNA；
RISC；
基因沉默
Progre of the study on RNA interference Abstract: RNAi is somekind Self-regulatory mechanism which widely exists in epiphyte, plants and animals,it is a phenomenon of gene silencing induced by double strandRNA,and also is the hotspot on life science with a wide range of application prospects.This study aimed to introduce the discovery , Mechanism and the apply in some fields of RNAi.Key words: RNAi;dsRNA;siRNA;RISC; Gene silencing RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的导致同源mRNA高效特异性降解的基因沉默现象。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默。与其它基因沉默现象不同的是，在植物和线虫中，RNAi具有传递性，可在细胞之间传播，此现象被称作系统性RNA干扰(systemic RNAi) 。RNAi是基因转录后沉默的一种方式，是生物界古老而且进化的高度保守的现象之一。
RNAi广泛存在于生物界，是生物体抵御病毒或其它外来核酸入侵以及保持自身遗传稳定的保护性机制。RNAi是通过siRNA介导的特异性高效抑制基因表达途径，由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA。RNAi具有生物催化反应特征，反应中需要多种蛋白因子以及ATP的参与。RNAi在基因功能研究和基因药物应用具有广泛的前景。
1.RNAi的发现历史
1990年，为加深矮牵牛花的紫色，Jorgensen等导入了一个强启动子控制的色素基因，可是结果与预期相反，许多花瓣颜色并未加深，反而呈杂色甚至白色，这是由于转基因和同源内源基因的表达都被抑制了，Jorgensen把这个现象命名为共抑制(cosuppreion)。
1995年，Guo等发现注射正义RNA和反义RNA均能有效并特异性地抑制秀丽新小杆线虫par-1基因的表达，该结果不能使用反义RNA技术的理论做出合理的解释。
1998年，Fire和Tabara首次将双链dsRNA—正义链与反义链的混合物注入线虫，结果表现出比单独注入单链要强得多的沉默，并且导致子一代同源基因的沉默，这也是人们第一次应用RNAi技术。
随后,Hammond还发现，不仅在线虫中， 在果蝇的研究中同样发现RNAi，尽管采用能生产dsRNA的酵母喂食果蝇的实验以失败告终，但是通过显微注射或者通过基因枪将dsRNA注入果蝇胚胎中或者将带有反向重复序列的DNA导入果蝇中能够引发基因沉默。后来RNAi相继在锥形虫（trypanosomes）、涡虫(planarian）、水螅（hydra）、斑马鱼（zebrafish）、真菌（fungi）、植物以及小鼠等不同种属的生物体中得以发现。
2002年，Zernicka-Coetz等用双链RNA注射小鼠受精卵和着床前的胚胎，结果发现导入的双链RNA可以特异性地抑制C-mos（c-mos是莫洛尼氏鼠类肉瘤病毒癌基因的同源基因）、钙粘附蛋白（E-cadherin）和绿色荧光蛋白（GFP）基因的表达。JudyLiebem1an和Premlata Shankar首先向公众宣布了在动物中利用RNAi技术治疗疾病的研究进展。
由于Fire和Mello解释了先前Guo S等无法解释的基因抑制现象而于2006年被授予诺贝尔生理医学奖。
2.RNAi的作用机制
目前有关RNAi在植物、动物、果蝇中的研究表明其大体分为起始阶段、效应阶段、循环阶段。
2.1起始阶段 2.1.1 dsRNA的形成
细胞中dsRNA的形成是RNAi 的第一步。外源DNA、RNA序列均可引起细胞产生相应的dsRNA，dsRNA可以是一个RNA分子回折自身互补而形成分子内双链，也可以是分开的两个RNA分子互补形成的分子间双链。如基因组中DNA 反向重复序列的转录产物或者同时转录反义和正义RNA 或者病毒RNA 复制中间体以及以细胞中单链RNA 为模板由细胞或病毒的RNA 依赖的RNA 聚合酶(RdRp) 催化合成dsRNA等。在线虫（c.elegans)可以直接注射dsRNA 或把线虫浸泡在含dsRNA 溶液中等方式引入外源dsRNA ,还可以通过喂养表达正义和反义RNA 的细菌获得dsRNA。
2.1.2 siRNA的形成和参与RNAi的蛋白因子
当细胞中的dsRNA扩增达到一定量时，dsRNA会在一种具有RNase Ⅲ样活性的核酸酶作用下加工裂解成21～23 nt（nucleotide）由正义和反义序列组成的小分子干扰RNA片段(small interferingRNAs，siRNA)，每个siRNA分子互补双链两侧3′末端具有2 nt的突出，5′端的磷酸基团会被一种特殊的激酶保护起来。
果蝇中RNase III 样核酸酶称为Dicer。
Dicer 含有解旋酶(helicase) 活性以及dsRNA 结合域。迄今为止已鉴定出包括Dicer在内的若干个与RNAi有关的蛋白因子。在果蝇（Drosophila melanogaster）RISC中，已知存在着称为Argonaute2(AGO2)的因子，AGO2蛋白的表达受到抑制时，RNAi效应缺失，也就是说AGO2是果蝇RNAi机制的必须因子。研究表明Argonaute家族蛋白具有RNA切割酶活性（slicer activity），RNAi机制正是由Argonaute家族蛋白的RNA切割酶活性主导。另外，几个RNA解旋酶(RNA helicase)也被鉴定为参与RNAi机制的因子。
在秀丽隐杆线虫（C.elegans）的RNAi中必须的因子有EGO1。这是一种RdRP(RNA-dependent RNA Polymerase)，植物中也存在该蛋白同系物。RNAi中RdRP是将标靶mRNA作为模板，以导入的dsRNA(或siRNA)作为引物合成RNA，在细胞内针对于标靶mRNA合成新siRNA的酶。这一反应在一些生物的RNAi中为必须，但RdRP活性在人和果蝇的RNAi中是非必须的，这说明在不同物种之间RNAi机制的基本框架虽然相同，但存在着微妙差异。
2.1.3 siRNA的结构特点
已发现在拟南芥(Arabidopsis）、线虫（c.elegans）、裂殖酵母（charomyces）以及哺乳动物中也存在Dicer 同类物干扰性小RNA( small interfering RNA ,或short interfering RNAs , siRNA) 是RNAi赖以发生的重要中间效应分子。
siRNA 是一类长约21～25 个核苷酸( nt ) 的特殊双链RNA(dsRNA) 分子,具有特征性结构,即siRNA 的序列与所作用的靶mRNA 序列具有同源性，siRNA 两条单链末端为5′端磷酸和3′端羟基，此外,每条单链的3′端均有2～3 个突出的非配对的碱基。
The structure of siRNA 对于体外人工合成的siRNA 来说,其活性发挥完全需要其双链中与靶RNA 互补的一条链5′端磷酸化,有时也需要与靶RNA 序列一致的另一条链5′端磷酸化。5′端磷酸化的siRNA 其活性明显高于非磷酸化siRNA 。
在果蝇胚细胞裂解物中,新生成siRNA 的磷酸化由一种能特异识别siRNA 的激酶催化生成,从而允许siRNA 参与多轮靶RNA 的裂解，该过程为ATP 依赖性。这种激酶能够区分
siRNA 5′-核糖和5′-脱氧核糖。
siRNA 的结构特征,即长21～23 nt、双链的两端各有2 个突出的3′碱基，5′的磷酸化使siRNA 不同于其它小dsRNA ,这是细胞赖以区分真正的siRNA 和其它dsRNA 的结构基础, 特异性激酶只保持真正siRNA 的5′端磷酸化状态,而对其它dsRNA 不发生作用,从而保证只有真正的siRNA 才能进入RNAi 途径并引发靶mRNA 的裂解。靶RNA 中的裂解位点受siRNA 中互补链5′端序列的影响,该链5′端的额外序列将导致靶RNA 中裂解位点的改变,而3′端的额外序列对靶RNA 中的裂解位点无明显影响。
因此,siRNA 5′磷酸可能充当靶RNA 裂解位点的一种分子参照。
Elbashir 等对果蝇胚细胞裂解物中siRNA 任意一条链或两条链同时进行2′-脱氧或2′- 氧-甲基修饰,结果siRNA 不能介导RNAi ,但对siRNA 3′端多个碱基进行2′-脱氧核苷酸替代修饰时仍具有RNAi作用。siRNA 识别靶序列的过程虽然高度特异,但并非siRNA 中的每一个位点对靶序列的识别均具有同等作用，siRNA 双链中心的碱基错配将不能引发靶
RNA 的降解。
Boutla 等研究显示,不同的合成siRNA 可引发果蝇胚胎细胞的RNAi ,这些siRNA 的点突变仅使其基因沉默功能轻度下降,提示基因沉默机制虽然要求一定的序列特异性,但并不过分严格。
2.2效应阶段
siRNA的反义链可指导形成一种核酸内切酶复合体，称为RNA induced silencing complexes(RISC)。RISC是由多种蛋白成分组成的，包括：内切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA链搜索活性等，其第一个亚单位为siRNA。RISC可利用结合在其上的内切核酸酶活性切割靶mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域，从而干扰基因的表达。线C.elegans 中的MUT7 (一种RNase D 样蛋白) 可能是一种3′5′-外切核酸酶。
此外, PAZPPiwi 蛋白家族成员可能是RISC中的构成组分,如Arabidposis中的AGO1 ；
N.Craa中的QDE2 ；
C.elegans 中的RDE1 等,以上这些蛋白与翻译因子eIF2C 同源。最新的研究进一步揭示,ATP 在siRNA 介导的RNAi 中具有重要作用。较长dsRNA 向siRNA 的转变要有ATP 参与，siRNA 与蛋白因子形成一个无活性的约360 kD 的蛋白PRNA 复合体，随之, siRNA双链结构解旋并形成有活性的蛋白PRNA 复合体(RISC) ,此步具有ATP 依赖性。
ATP 使siRNA 5′端带上磷酸分子,且对siRNA 的功能具有重要作用。上述过程中siRNA 双链结构解旋很可能是一种稳定的结构改变,因为siRNA 双链体与细胞裂解物、ATP 等孵育后再除去ATP 及其它辅助因子，引导RISC与靶mRNA结合时，siRNA 3′端倒数第2个碱基起的作用非常大，因此此处不能出现错配现象。
2.3循环阶段
含有siRNA 的活性复合体仍能识别和切割靶mRNA 分子。siRNA 可作为一种特殊引物,
在RNA 依赖RNA聚合酶(RdRp) 作用下以靶mRNA 为模板合成dsRNA ,后者可被降解形成新的siRNA ，新生成的siRNA又可进入上述循环。
这种过程称为随机降解性多聚酶链反应(random degradative PCR) 。
新生的dsRNA 反复合成和降解,不断产生新的siRNA ,从而使靶mRNA 渐进性减少,呈现基因沉默现象。
RdRp 一般只对所表达的靶mRNA 发挥作用,这种在RNAi 过程中对靶mRNA 的特异性扩增作用有助于增强RNAi的特异性基因监视功能。每个细胞只需要少量dsRNA 即能完全关闭相应基因表达,可见RNAi 过程具有生物催化反应的基本动力学特征。siRNA特异性地与mRNA结合，siRNA作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶作用下通过类似PCR的扩增作用再次形成dsRNA，新的dsRNA又被RNAase样的Dicer内切酶切割产生次级siRNA，次级siRNA又可以进入下轮循环。
3．RNAi的应用与相关讨论
RNAi 是植物、线虫、真菌、昆虫、原生动物以及动物的一种强有力的基因表达抑制途径,在生物体的发生发育及防御系统的构成等方面均具有十分重要的作用。已证实无脊椎动物和植物中的RNAi 机制可抑制侵入宿主体内的病毒和转座子(transposon) ,减弱和清除其基因毒性作用。在基因工程中将一转移基因导入植物细胞时出现的基因沉默作用也是宿主细胞的一种通过RNAi 机制实现的自我保护性反应。
3.1 RNAi在动植物中的应用
目前尚不清楚RNAi 在哺乳动物系统中所起的作用。哺乳动物基因组常面临高负荷病毒和自私DNA(selfish DNA) 的侵袭以及转录异常所带来的危害,对这些危及正常基因组完整性的因素来说,RNAi 可能是整个防御网络的重要组成部分。dsRNA 介导的特异性基因沉默作用也可能在哺乳动物基因表达的调控中起重要作用,例如X 基因的灭活等。总之,在动物和植物中RNAi 的功能之一是通过抑制生殖细胞中转座子的迁移和DNA 重复序列的积累来保持基因组的完整性和稳定性。
3.2 RNAi的细胞毒作用
此外，RNAi 也可作为一种防御机制抵抗病毒感染，2001年，Tuschl等将siRNA导入到哺乳动物细胞中并由此解决了在哺乳细胞内导入长的双链RNA时引发的干扰素效应，由此拓展了RNAi在基因治疗上应用前景。
RNAi机制普遍存在于动植物，尤其是低等生物中。因此被认为是进化上相对保守的基因表达调控机制。一种假说为，RNAi机制是作为在RNA水平上抵御病毒入侵的防御机制而存在的。在病毒自身基因组所包含的，或在病毒复制过程中产生的双链RNA可以被Dicer识别，从而引起病毒RNA降解。但是许多病毒为抵抗宿主的RNA干扰机制，会产生抑制宿主RNA干扰的蛋白，以保护病毒基因在宿主体内的顺利复制。已经发现的可以抑制宿主RNA干扰的病毒蛋白有potyviruses编码的HC-PRO蛋白、马铃薯X病毒编码的Cmv2b蛋白、兽棚病毒编码的B2蛋白等。RNA干扰也是抑制破坏基因结构的一种DNA片段转座子活性的重要方式。转座子通常以逆转座的方式在基因组中扩增。在逆转座过程中产生的双链RNA分子可以被Dicer识别，从而被降解。
3.3抗肿瘤方面的应用
肿瘤的发生是一种多基因协同作用的结果，利用RNAi技术可同时阻断多个癌基因的转录表达，从而有效抑制肿瘤的生长，达到治疗肿瘤的目的。
尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)是一种在肝癌细胞中高表达的蛋白，Salvi等用RNAi技术沉默肝癌细胞中尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)的表达，，结果转染靶向uPA的siRNA的肝癌细胞其侵袭、转移和增殖能力显著下降。Pardridge等以人表皮生长因子受体(HEGFR)为靶点，应用RNAi技术干扰其表达从而抑制颅内肿瘤的生长。
肿瘤的生长具有血管依赖性血管内皮生长因子(VEGF)是一种重要的血管生长因子。Han等报道用RNAi技术研究分析了血管内皮生长因子(VEGF)5种同型异构体基因功能，进一步
对血管生成基因进行敲除治疗癌症，并显示了较好的治疗结果。
因此，用RNAi技术沉默肿瘤发生发展过程中过表达的癌基因可抑制肿瘤的生长。
RNAi还可用于研究与肿瘤细胞生长分化相关的信号传导通路，并通过干扰细胞信号传导途径中关键蛋白的表达，达到抑制肿瘤生长的作用，为恶性肿瘤的基因治疗提供了新的技术方法。
3．4 RNAi在药物研究中的应用
利用RNAi能够特异高效地抑制基因表达,获得去基因功能表型,能够在短时间内大规模筛选靶点,从而实现了在细胞水平和动物水平筛选药靶和评定药靶。Hamamichi利用RNAi和基因敲除技术系统屏蔽帕金森病模型中将近900个候选基因和通路,找到了两个帕金森病遗传易感性位点和治疗靶点,从而为该疾病的治疗奠定基础。
RNAi在被广泛应用于功能基因组研究确定了大量潜在的药物作用靶点的同时,也被证实了其作为新一代基因治疗药物的可能性。2006年,美国Acuity制药公司生产的用于治疗湿性老年斑病变的RNAi药物—Bevasiranib在RNAi临床实验方面取得成功,它在疗效、安全性方面都优于常规药物。
目前,FDA已经批准Bevasiranib进入III期临床实验,而最终的试验结果将于2009年获得。
RNAi药物其他方面的应用,如治疗Huntington病和哮喘以及COPD也进入临床前研究阶段,但是RNAi药物仍存在如给药途径、使用安全性等方面的问题。
另外，发现RNAi机制中的相关一些因子如内源性双链RNA及蛋白因子可以在多种层次上对基因表达进行调控，其范围已经超越了PTGS（post transcriptional gene silencing），如RNAi机制同样参与了转录水平上的基因表达调控过程中。
从理论上讲，RNAi技术能选择性地沉默基因组中任何基因的表达。在实验室中，RNAi已经被广泛用来研究生命现象的遗传奥秘，特别是在哺乳动物中抑制那些无法敲除的基因的表达，已经发展成为研究基因功能有利的工具。与其他几种进行功能丧失的技术相比，RNAi技术具有明显的优点，它比反义RNA技术和同源共抑制更有效，更容易产生功能丧失,与造成的功能永久性缺失技术相比，RNAi技术更受人们青睐。而且通过与细胞特异性启动子及可诱导系统结合使用，可以在发育的不同时期或不同器官中有选择的进行。
4.展望
自从1998年Fire首次报导以来，RNAi研究迅猛发展，掀起了dsRNA介导的基因沉默作用分子机制及其生物学功能研究的热潮，使RNAi成为分子生物学领域最热门的研究课题之一。在美国《科学》杂志评出的2002年十大科技进展的排行榜中名列榜首。
由于RNAi干扰作用具有高效性和高特异性特点,能有效阻抑不必要或有害基因表达,对细胞及机体正常功能的发挥和维持至关重要。为多种病毒性或遗传性疾病以及肿瘤癌症等医学顽症的根治开辟了一条新的有效途径。RNAi不仅能大大推动人类后基因组计划的发展,还将应用于基因治疗、新药开发、生物医学等研究领域。因此,RNAi的研究与应用具有极其重要的理论和实际意义,将对医学生物学的发展产生深远的影响。
但我们注意到RNAi在其发展的过程中仍然存在许多问题需要解决，需要我们对它进一步研究和应用，并在生命的各个领域做出贡献。
参考文献：
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基因工程教学大纲
课程性质：专业课
课程教学目的：基因工程是分子生物学和分子遗传学等学科综合发展的基础上，于上个世纪70年代诞生的一门新的生物技术科学。它的创立和发展，直接依赖于基因分子生物学的进步，两者之间有着密切而不可分割的内在关系。通过基因工程的教学，达到如下教学目的：
1.使学生了解和掌握基因工程的基本概念和原理；
2.使学生了解基因操作的主要技术原理和应用；
3.使学生了解基因工程的研究内容和操作规程；
4.使学生初步掌握基因工程基本的实验操作技术。
课程教学原则与教学方法：
采用多媒体教学方法，并在教学过程中有机地结合以下几个基本教学原则。
1.突出直观教学的原则。通过多种直观教学形式如观察、实验、电影、投影、录相等，来丰富学生的直接经验和感性认识。
2.理论联系实际原则。在讲授理论之基础上，通过具体的实验操作使学生了解和掌握基因工程的基本操作技术和过程。
3.注重学生学习科学过程的原则。教学要将重点放在学生的学习过程上，而不是放在学习内容上，要让学生了解基因工程的科学过程。
4.既教书又育人的原则。教学过程中结合教学内容，对学生进行辨证唯物主义教育、爱国主义教育、职业道德教育等。
课程总学时：58学时；
课程教学内容要点及建议学时分配：
（一）教学内容要点
第一章 基因工程及其主要的研究内容
第一节 基因工程的诞生
1.理论基础 2.标志性研究
第二节 基因工程与相关学科之间的关系 第三节 基因工程的重要历史事件
第四节 基因工程的基本概念和主要的研究内容
1.遗传工程与基因工程 2.克隆与基因克隆 3.主要的研究内容和步骤 第五节 基因工程的安全性 1.基因工程的安全问题 2.物理防护标准 3.生物防护标准 第六节 基因工程的应用和展望
第二章 基因工程的主要技术原理
第一节 核酸的凝胶电泳
1.基本原理
2.琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰氨凝胶电泳 第二节 核酸的分子杂交
1.基本原理
2.southern印记杂交和northern印记杂交 3.菌落（或噬菌斑）杂交 第三节 细菌的转化
1.肺炎球菌的转化 2.大肠杆菌的感受态 3.大肠杆菌的转化 第四节 DNA核苷酸序列分析
1.双脱氧测序 2.化学法测序 3.序列测定的自动化 第五节 基因的定点诱变
1.盒式诱变 2.寡核苷酸引物诱变
第六节 研究DNA与蛋白质相互作用的方法
1.凝胶阻滞试验 2.DNaseI足迹试验
第七节 聚合酶链式反应技术与基因扩增
1.PCR技术的基本原理和特点 2.Taq DNA聚合酶 3.寡核苷酸引物 4.PCR技术的应用
第三章 基因工程的酶学基础
第一节 核酸限制性内切酶与DNA分子的体外切割
1.寄主控制的限制与修饰现象 2.限制性内切酶的类型和基本特性 3.II型限制性内切酶的基本特性 4.核酸限制性内切酶的命名法 5.影响限制酶活性的因素
第二节 DNA连接酶与DNA分子的体外连接
1.DNA连接酶
2.粘性末端和平末端的连接 第三节 DNA聚合酶
1.DNA聚合酶与缺口平移法制备核酸杂交探针 2.Klenow酶和DNA末端标记
3.T4DNA聚合酶和取代合成法标记DNA片段 4.逆转录酶与cDNA的合成 第四节 DNA及RNA的修饰酶
1.末端转移酶与同聚物加尾 2.T4多核苷酸激酶与5末端的标记 3.碱性磷酸酶与DNA脱磷酸作用 第五节 核酸外切酶 第六节 单链核酸内切酶
第四章 基因克隆的载体
第一节 质粒载体
1.质粒的一般生物学特性 2.质粒DNA的复制与拷贝数的控制 3.质粒DNA的分离与纯化 4.质粒载体的类型 5.重要的大肠杆菌质粒载体 6.质粒载体的稳定性问题 第二节 噬菌体载体
1.双链噬菌体载体—λ噬菌体载体 2.单链噬菌体载体—M13噬菌体载体 第三节 柯斯质粒载体和噬菌粒载体简介
1.柯斯质粒载体 2.噬菌粒载体
第五章 基因克隆与鉴定
第一节 DNA克隆片段的产生与分离
﹩1.基因组DNA的片段化 2.DNA片段的大小分布
第二节 重组体DNA分子的构建及导入受体细胞
1.外源DNA片段同载体分子的连接重组 2.重组体分子导入受体细胞的途径 第三节 基因克隆的实验方案
1.互补作用基因克隆 2.cDNA克隆 3.基因组DNA克隆 第四节 克隆基因的分离
1.应用核酸探针分离克隆的目的基因
2.应用差别杂交或扣除杂交法分离克隆的目的基因 3.应用mRNA差别显示技术分离克隆的目的基因 4.应用表达文库分离克隆的目的基因 第五节 重组体分子的选择和鉴定
1.遗传检测法 2.物理检测法
3.菌落或噬菌斑杂交筛选法
（二）建议学时分配
第一章 基因工程及其主要的研究内容 4学时 第二章 基因工程的主要技术原理 8学时 第三章 基因工程的酶学基础 8学时 第四章 基因克隆的载体 12学时 第五章 基因克隆与鉴定 12学时
课程的实践教学环节要求：实验课在理论课讲授完之后集中进行，每组原则上不超过20人。由于基因工程实验耗时长、所需仪器设备及试剂药品多而复杂等特点，实验课的开设情况根据实验条件允许进一步调整。在本院实验条件允许的情况下，将以基因工程大实验的方式连续进行，正取一周内集中完成。
教材与主要教学参考书：
1.尹俊、邢万金、恩和巴雅尔、刘丽华编著。基因工程.呼和浩特。内蒙古大学出版社2006.9 2.吴乃虎 编著.基因工程原理（第二版）.北京，科学出版社.1998.3 3.陆德如，陈永青 主编.基因工程.北京，化学工业出版社.2002.7 4.萨木布鲁克等编著，金冬雁等译，分子克隆实验指南（第三板）.北京，科学出版社.2002 5.奥斯伯等 编著（美），颜子颖、王海林译.精编分子生物学实验指南.北京，科学出版社1998.6 6.第四军医大学分子生物学教研室等制作.分子生物学多媒体教程—PCR理论、实践与应用.北京，高等教育出版社.1998 7.英国皇家医学院制作，军事医学科学院译.遗传工程实验技术录象教材.1994 课程考试与评估：
1．平时成绩占40% ，其中：作业和平时测验30% + 考勤10%， 期末考试占60%，闭卷考试。
2．评估：系教学委员会和教研室不定期对教师的讲授情况以听课、与学生座谈等方式进行了解并作出评估，并与学生的评估结果结合，作出综合评估。
（执笔人：恩和巴雅尔）
《基因工程及其应用》教学设计 求是高级中学 赵文俊
一、教学内容分析
本节课内容是人教版生物必修二第六章第二节内容。包括以下三方面内容：基因工程原理、基因工程的应用、转基因生物和转基因食品安全性。
本节简要介绍了基因工程的原理，使学生对基因工程有一个基本的认识。为了避免与选修3中基因工程的内容重复，教材没有过多地展开介绍。教材结合实例介绍了基因工程在作物育种、药物研制、环境保护等方面的应用，最后，将重点放在对转基因生物和转基因食品安全性的讨论上。
二、学生情况分析
学生通过前面的学习已经掌握了不少培养生物新品种的方法，杂交育种、诱变育种、单倍体育种、多倍体育种等方法都局限于同一物种进行的操作。能否跨越物种的界限呢？通过身边的实际可激发学生学习兴趣，引入基因工程的概念。学生之前在已经学习了主要遗传物质DNA的结构、基因的概念和功能、基因重组，对于理解基因工程中的“剪切连接”有一个物质基础。
三、教学目标及教学重难点
（一）教学目标 1．知识与技能目标：
（1）简述基因工程的基本原理。
（2）举例说出基因工程在农业、医药等领域的应用。
（3）收集基因工程所取得的成果以及发展前景。
2．过程与方法目标：
（1）培养学生信息解读和知识迁移转化的能力。
（3．情感态度价值观目标：
（1）关注转基因生物和转基因食品的安全性。
（2）通过辩论，使学生体验参与社会问题的讨论和决策的方法。
（3）通过学习了解我国基因工程的发展前景及成果，激发学生对于生物知识的兴趣，开阔学生的思路，养成学生的爱国主义热情，树立在学习上努力刻苦的决心。
（二）教学重难点：
1．教学重点
（1）基因工程的基本原理。（2）基因工程的安全性问题。
2．教学难点
（1）基因工程的基本原理。（2）转基因生物与转基因食品的安全性。
五、教学过程
1．导入：思考：棉花无抗棉铃虫性状（细胞中无抗虫基因及其等位基因），但苏云金芽孢杆菌的细胞中有抗棉铃虫基因，我们怎样才能获得抗虫棉呢？能用杂交育种吗？能用诱变育种吗？
2.基因工程的概念：基因工程，又叫做 技术或 。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一
种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里， 地改造生物的 。
（以抗虫棉为例，对概念进行说明，便于学生理解） 3.以抗虫棉为例，和学生一起探讨基因工程的一般步骤，在一般步骤的学习过程中，掌握基因操作的工具。
4.用一个语音视频对基因工程的一般步骤加以巩固。
5.学生自主学习基因工程的运用
6.用一段新闻帮助学生正确认识转基因食品的安全性问题。
六、板书设计：
第二节基因工程及应用
（一）基因工程 1.概念 2.原理 3.步骤
（1）提取目的基因 （限制酶）
（2）目的基因与运载体结合 （连接酶 运载体 ） （3）将目的基因导入受体细胞 （4）目的基因的检测和鉴定
（二）基因工程的应用
（三）转基因生物和食品的安全性
七、教学反思
八、课后检测：
1.基因工程的正确操作步骤是: ①使目的基因与运载体结合 ②将目的基因导入受体细胞
③检测目的基因的表达是否符合特定性状要求 ④提取目的基因
A ③ ② ④ ① B ② ④ ① ③ C ④ ① ② ③ D ③ ④ ① ②
2.要使目的基因与对应的载体重组，所需的两种酶是( )
①限制酶 ②连接酶 ③解旋酶 ④还原酶
Ａ．①② Ｂ．③④ Ｃ．①④ Ｄ．②③ 3.下列关于基因工程的叙述中,正确的是 A.限制酶只用于提取目的基因 B.细菌体内的环状DNA均可作运载体 C.DNA连接酶可用于目的基因和运载体的连接 D.重组DNA分子一旦进入受体细胞,基因工程则完成 4.以下说法正确的是: A.目的基因是指重组DNA B.一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 C.DNA重组所用的工具酶是限制酶、连接酶和运载体
D.只要受体细胞中含有目的基因，目的基因就一定能够成功表达
5.2006年.四川）用基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋白质。下列说法不正确的是
A.常用相同的限制性核酸内切酶处理目的 基因和质粒 B.DNA连接酶和RNA聚合酶是构建重组质粒必需的工具酶 C.可用抗生素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒 D.导入大肠杆菌的目的基因不一定能成功表达.
课题：基因工程的操作工具
授课教师：北京师范大学附属实验中学 王卫红
一、教学目标 知识目标：
简述基因工程操作的基本工具；
说明限制性核酸内切酶、DNA连接酶和运载体在基因工程操作中的作用。
能力目标：
动手模拟限制性内切酶的酶切作用和DNA连接酶的连接作用。
情感态度价值观目标：
体验科学研究中技术手段的进步对科学研究的巨大推动作用；
体验科学研究的思路和方法。
二、教学重点
限制性核酸内切酶、DNA连接酶和运载体在基因工程操作中的作用
三、教学难点
限制性核酸内切酶、DNA连接酶和运载体在基因工程操作中的作用
四、教学资源
浙科版《选修3：现代生物科技专题》、自制教学PPT、纸质模型
五、教学过程
1． 情境导入：
演示药物胰岛素图片，说明胰岛素是很多的糖尿病患者最好的药物，每天要注射胰岛素来维持血糖的平衡，曾经胰岛素是从动物胰脏中提取的，几吨的胰脏只能提出几十克胰岛素，所以曾经胰岛素是非常昂贵的药物，但是在科学技术飞速发展的今天，情况早已经发生了变化，人们通过基因工程将基因导入大肠杆菌细胞中来生产胰岛素？如何生产？ 这也是基因工程的基本内容，基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
但是如何完成这个操作过程？将胰岛素基因叫目的基因，被导入的细胞叫受体细胞。
2．提出问题分析基因工程操作中需要哪些工具：
提出问题：1.如何获得人胰岛素基因？
2．能否将人的胰岛素基因直接注入大肠杆菌细胞？
提供材料：原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。当外源DNA侵入时，会利用一种酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。
通过分析明确：1.DNA分子要被被切成片段后导入受体细胞。
2．导入受体细胞需要有运载体，否则会被切断或破坏
针对以上问题，在基因工程的操作水平有相应的分子工具应该包括，分子剪刀、胶水和运载体。
3.了解三种工具：
3.1 限制性核酸内切酶：1970年Smith等分离并纯化了限制性核酸内切酶Hind II， 1972年，H.W.Boyer等相继发现了ＥcoR I 一类重要的限制性内切酶。
科学家们发现的这些酶，可以剪断外来的DNA分子，即上述内容中提到的酶，作用是防御外来DNA入侵，这类酶对基因工程的操作有没有作用呢？可以作为剪刀！限制性核酸内切酶，在科学家的继续研究
1 中发现了几千种酶，而且能识别特定序列，并在特定位点进行切割，如GAATTC序列，在G、A之间切开。
切开什么位置？复习DNA的分子结构，回忆磷酸二酯键，被切开后什么样？
活动1：用EcoR I酶切开有两个GAATTC的纸质DNA分子 讲解粘性末端和平末端
活动2：提供两个不同序列的纸质运载体DNA，选择哪个？为什么？学生选择后切开。
如果和运载体连接的话怎么办？运载体被相同的酶切开相同的切口再黏上，黏什么键？磷酸二酯键
3.2 DNA连接酶：
1967年，世界上有五个实验室几乎同时发现DNA连接酶，特别是1970年H.G.Khorana等发现的T4 DNA连接酶具有更高的连接活性。
分析DNA连接酶和DNA聚合酶的不同，DNA连接酶，连接的部分为磷酸二酯键，DNA聚合酶连接的也是磷酸二酯键，两种酶的作用有何不同？DNA连接酶：连接两个片段之间的缺口，不需要模板；
DNA聚合酶：将一个个单个的核苷酸接上去，需要模板（画简图）
3.3 运载体：
通过上述活动分析，什么样的DNA适合做运载体？应该有多种限制酶切点，在宿主细胞中稳定保存，可复制，有标记基因，便于筛选。常用的运载体是细菌质粒和噬菌体DNA。
4．归纳笔记
六、板书设计
二、基因工程
1． 基因工程的操作工具
（1）限制性核酸内切酶
分布：主要在原核生物中
作用特点：识别特定核苷酸序列，切割特定切点
切点：磷酸二酯键
举例：EcoRI限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开 （2）DNA连接酶——“针线”
DNA连接酶：连接两个DNA分子片段间的磷酸二酯键
DNA聚合酶：连接一个脱氧核苷酸到DNA片段上，需要模板 （3）运载体——“运输车” 载体必须具备的条件：
1、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；
2、具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；
3、具有某些标记基因，便于进行筛选。（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等 ）
常用的载体有：质粒，噬菌体，动植物病毒等
基因工程
基因工程的应用
基因工程是一种按人们的构思和设计，在试管内操作遗传物质，并最终实现改造生物的新技术。基因工程对生物的改造，可以使生物像工厂似的为人类生产特殊产品，也可以使现有的动植物更符合人类的要求。
基因工程在医药业中的应用。利用基因工程生产蛋白类药物，可提高产量，降低成本。如干扰素是一种蛋白质，能抑制癌细胞增殖，增强身体的防御功能。前田进[日]博士采用基因工程技术，使蚕生产人干扰素获得成功。他发现，附在蚕体内的NPV（核多角体病毒）增殖效果好，在蚕的一个细胞核中可以增至100万个。他把带有干扰素基因的重组体NPV接种到蚕体内，蚕便在体液中分泌出干扰素。
基因疗法是基因工程的又一重大应用。遗传病是长期困扰人类的一类不治之症，迄今已发现的有3000多种。其根源于遗传基因存在缺陷，主要特征是可随生育而传代。基因疗法就是通过向人体细胞的基因组置换"坏了的"基因，或引入外源的正常基因治疗疾病的方法。如血友病的病根在于血液中缺乏凝血因子VIII 。它是一种化学结构不很稳定的蛋白质。如今，可用人工的方法将产生凝血因子VIII 的基因提取出来，然后将其转移到患者的细胞基因组中，弥补遗传缺损，从而能够产生正常的凝血因子VIII ，使体内血液循环正常。
基因工程在农业上的应用。1991年初，美国DNA植物技术公司的科研人员同时栽种了三批烟草植株。数月之后，其中一批由于遭受土壤中真菌的感染而严重损害；
另一批由于使用了市售的化学杀菌剂而生长良好。而在第三批烟草植株上，它们没有使用任何杀真菌剂，却生长得特别旺盛，收获产量比前两批的都高。这是因为这批烟草并非普通烟草，而是基因重组的产物。
真菌的细胞壁中有一种重要成分叫几丁质，几丁质如果受到破坏，真菌就无法肆虐。自然界有一细菌天然含有能产生几丁质酶的基因，产生的几丁质酶是破坏几丁质的最有效催化剂。美国DNA植物技术公司的科研人员从一种细菌中发现了这种基因，并且运用基因工程技术把它插进了烟草植株中，于是诞生了具有抗真菌能力的新型烟草。
除了应用基因工程使作物获得抗真菌、细菌和线虫的能力外，目前还正在试图利用基因工程手段提高作物的抗逆性和营养价值。
科学家们预言，若能用基因工程将固氮基因插入各种非豆科植物染色体组内，则可将空气中的氮直接转化为植物生长所需的氮，那将是农业生产的一次大的飞跃。
基因工程在工业方面的应用。有一种超级细菌，能快速分解石油，可用于清除被石油污染的海域。这种超级菌是美国科学家用基因工程方法，把降解不同石油化合物的基因移植到一个菌株内而产生的。
氢气在燃烧过程中，除释放能量外，产生的废物只有水，不会造成环境污染，被称为理想、清洁的燃料。一些水中生长的微生物在光照下，会不断地将水分解，放出氢气，然后可用容器将氢气收集起来。日本一研究所以提高光合作用微生物生产氢的效率为目标，正在利用基因重组技术，改良微生物，以大幅度地提高生产氢气的能力，为利用微生物生产氢气尽早投入实际生产和应用创造条件。
什么是转基因食品
专家介绍，转基因是指透过生物技术，将生物中某个基因抽出，然后植入另一种生物内。通过修改基因，能够改变一个有机体的部分或全部特征。例如，科学家认为北极鱼体内某个基因有防冻作用，于是将其抽出，再植入番茄内，制造新品种的耐寒番茄。而用此作为原料制造的食品则被称为转基因食品。
转基因食品的安全问题
其实，最早提出这个问题的人是英国的阿伯丁罗特研究所的普庇泰教授。1998年，他在研究中发现，幼鼠食用转基因土豆后，会使内脏和免疫系统受损。这引起了科学界的极大关注。随即，英国皇家学会对这份报告进行了审查，于1999年5月宣布此项研究“充满漏洞”。1999年英国的权威科学杂志《自然》刊登了美国康乃尔大学教授约翰·罗西的一篇论文，指出蝴蝶幼虫等田间益虫吃了撒有某种转基因玉米花粉的菜叶后会发育不良，死亡率特别高。目前尚有一些证据指出转基因食品潜在的危险。
但更多的科学家的试验表明转基因食品是安全的。赞同这个观点的科学家主要有以下几个理由。首先，任何一种转基因食品在上市之前都进行了大量的科学试验，国家和政府有相关的法律法规进行约束，而科学家们也都抱有很严谨的治学态度。另外，传统的作物在种植的时候农民会使用农药来保证质量，而有些抗病虫的转基因食品无需喷洒农药。还有，一种食品会不会造成中毒主要是看它在人体内有没有受体和能不能被代谢掉，转化的基因是经过筛选的、作用明确的，所以转基因成分不会在人体内积累，也就不会有害。
比如说，我们培育的一种抗虫玉米，向玉米中转入的是一种来自于苏云金杆菌的基因，它仅能导致鳞翅目昆虫死亡，因为只有鳞翅目昆虫有这种基因编码的蛋白质的特异受体，而人类及其它的动物、昆虫均没有这样的受体，所以无毒害作用。
1993年，经合组织（OECD）首次提出了转基因食品的评价原则——“实质等同”的原则，即：如果对转基因食品各种主要营养成分、主要抗营养物质、毒性物质及过敏性成分等物质的种类与含量进行分析测定，与同类传统食品无差异，则认为两者具有实质等同性，不存在安全性问题；
如果无实质等同性，需逐条进行安全性评价。
在我国，国家科委于1993年颁布了“基因工程安全管理办法”，用于指导全国的基因工程研究和开发工作。2000年由国家环保总局牵头，8个相关部门参与，共同制订了《中国国家生物安全框架》。
对于消费者
对转基因食品持否定态度的人认为，目前对基因的活动方式了解还不完全透彻，没有十足的把握控制基因调整后的结果。为了确保消费者的安全和知情权，国家对5大类17种食品或产品，要求必须进行是否转基因标注。这些产品包括：
一、大豆种子、大豆、大豆粉、大豆油、豆粕；
二、玉米种子、玉米、玉米油、玉米粉；
三、油菜种子、油菜籽、油菜籽油、油菜籽粕；
四、棉花种子；
五、番茄种子、鲜番茄、番茄酱。
转基因食品是否会产生不良影响，中国疾病预防控制中心营养与食品安全所吴永宁教授认为，凡是允许在中国销售的转基因食品，都要通过国家农业部转基因办公室、专家委员会和相关检验机构的严格评审、检测，已经通过安全性评价的转基因食品，由国家农业部颁发安全合格证书后，方能投入进行食品加工。从营养安全的角度讲，目前还没有发现转基因食品不利于人体健康的证据，也没有出现由此引发的食品安全纠纷。
由于转基因食品是否对健康有影响到目前为止还没有明确结论，因此世界上一些国家对转基因技术，特别是转基因食品持慎重态度，专门为转基因食品建立了管理制度，要求生产厂商，尽到告知义务。
转基因食用油安全吗
中国是食用油的消费大国，大豆、菜籽、玉米是主要的食用油原料，国家要求标注的转基因食品或产品中，这3种农作物均榜上有名。食用油作为消费者日常生活的必需品，自然成为被关注的焦点。目前国内的转基因油料作物，例如大豆，主要来自阿根廷、美国等国家。转基因油料作物受到青睐的原因很简单，产量大、出油率高，竞争中具有价格优势。业内人士称，国产非转基因大豆的出油率约16%，而进口转基因大豆的出油率约20%。据估算，平均每桶5升非转基因大豆油要比转基因大豆油的成本高2〜3元。
针对转基因食用油的安全性问题，行业各界仍然持不同态度。
对转基因食用油持支持态度的观点认为，转基因食品通过国家相关部门严格的安全性评价，并没有发现对健康的不利影响。中国农业大学食品科学与营养工程学院教授朱本忠教授认为：“虽然从科学技术上还不能直接断定转基因产品是否对人体有害，但转基因大豆已经通过了国家相关部门的安全性评价，证明是安全的。”中国农业大学教授黄昆仑表示:“市场上售卖的转基因食品，都是经过国家相关部门的检测，进行了安全性评价。目前，我国和已经食用转基因大豆8年的美国并没有在消费者中产生明显的不利症状。”
而反对使用转基因作为食品原料的观点认为，尽管尚未发现转基因食品对人的健康造成危害，但并不表明它就是绝对安全的。国家环境保护总局生物安全办公室的王捷表示：“尽管截至目前尚未发现转基因食品对人的健康造成危害，但是并不能说它就是绝对安全的，也许它的影响需要一定的时间才能显现出来。对于有可能出现的潜在风险，必须引起高度重视。”
中国农业大学的罗云波教授表示，任何一种作物被确定是否用转基因技术改造时，首先要对该种作物本身进行安全性评价，要确保其对人体不会产生不良反应，有些人不了解什么是转基因，认为转基因食品是在食品或农作物中添加了叫“基因”的东西。罗教授认为，任何食品都是由成千上万基因组成，传统品种改良通过杂交，实际上也是基因的交换，而基因技术是定向改造生物，跟杂交育种没有本质区别。作为消费者，罗教授本人非常接受转基因食品，因为转基因食品至少有两点好处，一可以减少农药残留，二可以强化某些营养成分。
自2004年5月1日起，国家标准化管理委员会会同农业部等组织强制要求，在我国生产销售的食用大豆油、菜籽油必须标明原料大豆、油菜是否是转基因产品。如果原料为进口，则须注明它的原产国。国家的强制规定使消费者有了知情权和选择权，是否购买转基因产品，决定权完全在消费者手里。
基因工程的优点
提高农作物产量，减少环境污染。盐碱、干旱、病虫害是造成农作物绝收、减产的主要原因之一，利用 DNA 重组技术、细胞融合技术等基因工程技术将多种抗病毒、抗虫害、抗干旱、耐盐碱的基因导入农作物体内，获得具有优良性状的转基因新品系，大大降 低了生产成本，提高了产量。许多科学家认为，转基因技术可以把发展中国家的农业生产率提高25%，困扰人类的缺粮问题有望得到解决。同时，转基因技术的应用，可以减少或避免使用农药、化肥，极大地减少了农药、化肥所造成的环境污染、人畜伤亡等事故。
延长果蔬产品的保鲜期。蔬菜、水果传统的保鲜技术如冷藏、涂膜、气调保鲜等，在储藏费用、期限、保鲜效果等方面均存在严重不足，常常导致软化、过熟、腐烂变质， 造成巨大损失。通过转基因工程技术可直接生产耐贮果蔬已成为现实。比如，在普通的蕃 茄里加入一种在北极生长的海鱼抗冻基因，就能使它在冬天保存更长间，大大延长保鲜期。目前，国内外都已有商品化的转基因耐贮蕃茄生产。其相关研究已扩大到草莓、香蕉、芒果、桃、西瓜等。
改善食品的口味和品质。传统的食品通过添加剂来改变口味，加入防腐剂延长食品 的保质期，然而添加剂和防腐剂中都含有有害成份，转基因技术可以较好地解决上述不足。通过转变或转移某些能表达某种特性的基因，从而改变食品的口味、营养成分和防腐功能。如利用外源基因导入或基因替换技术可以改善牛奶的成份，生产特定人群的食用牛奶 。此外，还可以将一些动物的基因转移到植物中去，使植物性食品带有某些动物性的营养成份及口味。转基因技术同样为改良动物性食品品质、培养优良的新品系提供了有效途径，目前转基因鱼、鸡、猪等的研究取得了很大的进展。
转基因食品还有以下6个优点：
1、解决粮食短缺问题。
2、减少农药使用，避免环境污染。
3、节省生产成本，降低食物售价。
4、增加食物营养，提高附加价值。
5、增加食物种类，提升食物品质。
6、促进生产效率，带动相关产业发展。
如果我是农场主，我会告诉消费者转基因食品的优点。我会告诉他们：（1）转基因食品的营养附加值比普通食品的营养附加值要高很多；
（2）转基因食品不施农药,没有农药残留；
(3)转基因食品保鲜期长。而且转基因食品经国家验证属安全食品。
基因工程
添加时间：2008.10.29 | 作者：admin
基因工程实验注意事项
1． 上实验课的学生每三人分为一个小组。
2． 课前要预习实验内容，弄懂实验设计的原理，理清实验顺序。认真制定实验方案（没有方案或方案不合理者不能进入实验操作）。
3． 实验指导中所写的实验
一、实验二等并非严格的实验顺序，只是提供一种相关的实验操作技术。各小组学生应根据整体的实验策略制定自己的实验顺序和计划。
4． 由于实验内容多，时间短，多数实验需要同时或穿插进行，一定要做好统筹安排。
5． 本实验课中的所有单项实验都属于一个整体流程。实验时间安排上没有上下午晚上等严格的作息安排，一切服从实验进度，必须在两周之内完成。
6． 实验的每一步都要详细地记录操作内容、时间、步骤、结果等，以备查询！
7． 对任何自己不熟悉的实验仪器都不要随意操作（尤其是微量移液器和离心机！）。在操作的过程中发现任何意外的现象都要及时向任课教师汇报。
8． 写作实验报告和实验论文一定要文理通顺、逻辑清晰、图表说明详细，讨论分析透彻（包括操作的错误）。
9． 在实验室内不能大声喧哗。
10．在实验的过程中制造的任何垃圾都要丢到垃圾筐里（或先放在自己的桌面一角），严禁随地投弃！特别注意对废弃细菌的杀灭和有毒垃圾的定点投放。
11．实验结束后要把用过的器皿清洗后归放整齐并清点数目，向教师汇报征得同意后方可离开实验室。
12．值日组的同学最后离开，等待清扫实验室的卫生，关闭门窗水电。
13．实验时损坏的任何物品都要及时申报。
实验流程参考图
PCR扩增CHI
制备感受态菌XL1-Blue
提质粒pBS-CHI，Pinpoint™xa-3 11ppMD18-TppMD18-T
EcoRV+BamHI酶切
与pUCm-T连接
转化XL1-Blue
筛选鉴定
提重组质粒pUCm-T-CHI
回收Pinpoint™xa-3
EcoRV+BamHI酶切
回收CHI片段
重组质粒Pinpoint™xa-3-CHI
IPTG诱导表达
SDS-PAGE检测
转化XL1-Blue
与Pinpoint™xa-3连接
Pinpoint™xa-3
pBS-CHI
XL1-Blue
XL1-Blue BL21（DE3）
筛选鉴定
提重组质粒Pinpoint™xa-3-CHI
转化XL1-Blue
重组质粒pUCm-T-CHI
第一部分质粒DNA的提取和酶切电泳鉴定
实验一 质粒DNA的小量制备
1．目的
学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。
2．原理
根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。
3．器材
超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌器等。
4．试剂
Pinpoint™xa-3质粒载体菌，pBS-CHI载体菌，LB培养基1000ml（含100µg/ml氨苄青霉素），葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液（溶液 I），NaOH/SDS溶液(溶液 II)，KAc溶液（pH4.8）(溶液 III)，RNase A，95%乙醇，70%乙醇，TE buffer（pH8.0）。
5．实验准备
氨苄青霉素储存液（无菌水配制5mg/ml，分装后-20°C保存），配制LB培养基（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g加200ml ddH2O 搅拌完全溶解，用约200ml 5N NaOH调pH至7.0，加ddH2O至1L，121°C 20min灭菌）；
溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，10mmol/L EDTA pH8.0）；
溶液II（0.2mol/L NaOH，1% SDS）；
溶液III（60ml 5mol/L Kac，加冰乙酸调pH4.8，补dd H2O至100ml），75%乙醇（-20°C保存），TE buffer（10mmol/L Tris HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0）；
10mg /ml RNase A（RNA酶A溶于10mmol/L Tris HCl pH7.5，15mmol/L NaCl中）；
摇菌试管洗净并盖上棉塞、1.5ml离心管装入铝制饭盒、移液器吸头装入相应的吸头盒，一起高压灭菌（121°C 30min）。
6．操作步骤
（1） 在超净工作台中取5ml LB（Amp），加入灭菌的摇菌试管中。
（2） 从超低温冰箱中取出保存Pinpoint™xa-3载体的菌种和pBS-CHI的菌种（操作完后迅速把菌种放回超低温冰柜中，切不可将菌融化！），在超净工作台上用烧红的接种环刮一下，再把接种环于无菌LB培养液（含100µg/ml氨苄青霉素）中搅拌一下，37°C摇床中摇12~16h。
Pinpoint™xa-3菌：
接种于5ml LB（Amp）；
pBS-CHI菌：接种于2ml LB（Amp）。
（3） 取1.5ml的菌液于1.5ml离心管中，15000rpm离心1min，弃上清液（尽量弃干净），留沉淀备用。
Pinpoint™xa-3菌：3管（3×1.5ml）；
pBS-CHI菌：1管（1.5ml）。
（4） 在沉淀中加入100µl 溶液I，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。（等待的同时，取一个塑料盒，装上适量的冰块备用。）
（5） 加入200µl 溶液II，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。
（6） 加入150µl 溶液III，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。
（7） 15000rpm离心5min，小心吸取400µl 上清液于另一个干净的1.5ml离心管中，（不要将白色沉淀物带入！），加入800µl 无水乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。
（8） 15000rpm离心10 min，小心弃掉上清液，加入500µl 75%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。15000rpm离心10 min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净。
（9） 再加入500µl 75% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。15000rpm离心10 min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净。
（10） 离心管倒置于37°C培养箱中（或室温）空气干燥。（管底的沉淀质粒DNA用肉眼几乎看不见！）。
（11） pBS-CHI加入30µl 无菌蒸馏水或TE缓冲液；
3管质粒中每管加入10µl蒸馏水混匀后收集到一个管中，涡旋混合器上混匀，在离心机中瞬时转一下，使溶液集中在管底。待电泳确认（见实验二）后再在Pinpoint™xa-3质粒中加入1µl RNaes A。用记号笔标记后放入冰箱中备用。
r
r
r（12） 清理桌面，清洗仪器，撰写实验报告。
7．思考
（1） 影响本实验结果的因素有哪些？
实验二 质粒DNA电泳鉴定
1．目的
学会常用的DNA琼脂糖凝胶电泳、。
2．原理
DNA双螺旋分子骨架两侧带有含负电荷的磷酸根，在电场中会向正极方向移动。不同长度的DNA由于受到凝胶介质的阻力不同，表现为不同的迁移率而被分开。
3．器材
电泳仪，水平凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块，250ml三角瓶，微波炉，台式离心机，旋涡混合器，凝胶成像系统，分光光度计，微量移液取样器，1.5ml离心管，双面微量离心管架，试管架等。
4．试剂
Pinpoint™xa-3质粒，pBS-CHI载体，TAE电泳缓冲液，荧光染料，电泳级琼脂糖粉，10´加样缓冲液（或6´加样缓冲液），DNA分子量标准（DL2000）。
5．实验准备
配制TAE电泳缓冲液（50´储存液，pH约8.5：Tris碱 242g，57.1ml冰乙酸，37.2g Na2EDTA.2H2O，ddH2O 定容至1L），10´加样缓冲液（20% Ficoll 400，0.1mol/L Na2EDTA pH8.0，1.0% SDS，0.25%溴酚蓝）；
6´加样缓冲液（0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液）；
1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。
6．操作步骤
（1） 称取0.5g琼脂糖粉，放入三角瓶，加入50ml TAE电泳缓冲液(1´)，放入微波炉中烧开（1min）。50ml 正好倒两块小胶。
（2） 注意观察烧瓶中的琼脂糖粉末，待完全熔化后停止微波炉（切不可让胶溶液溢出到微波炉中！）。
（3） 戴上线手套，从微波炉中取出三角瓶，置桌面上冷却致不烫手（约50~60°C）。
（4） 把梳子插到凝胶灌制模具的正确位置后缓缓倒入胶溶液。胶溶液倒至与模具的矮边缘相平即可，不要把胶溶液溢到外面。在桌面上静置10~20分钟待胶完全凝固。（剩下的胶溶液封口后留待以后再熔化使用）。
（5） 在水平电泳槽中加满1´TAE电泳缓冲液。根据电泳槽的长度把电泳仪的电压调至170V(10V/cm)，注意正负电极的位置连接正确。
（6） 待胶完全凝固后（15~20分钟），小心拔出梳子。用手指捏住模具两侧的高边缘取出模具和凝胶放入电泳槽中间的平台上，凝胶要没入电泳液中。凝胶上有样品孔的一侧要朝向电泳槽的负极。
（7） 剪1片光面纸（或封口膜），点6µl蒸馏水、1µl 10´加样缓冲液，再加入3µl质粒DNA溶液制成10µl DNA样品。
（8） 在凝胶上选择相邻的加样孔。用10µl的吸液头分别将管中的样品加入凝胶的加样孔中（如果需要时，在相邻的加样孔中加入1.5-3µl DNA分子量标准物）。加样时持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手扶住这只手的手腕，以减少移液器的抖动。看到蓝色的样品吸管尖头伸进加样孔后（不能伸得太深，以免穿破凝胶的底部）缓缓将蓝色的样品压入加样孔中。切不可使蓝色样品流到孔外。
（9） 打开电源开关，样品将形成一条蓝色的横带向前移动（如果发现蓝色向后移动，立即关闭电源，调换电极）。电泳将进行约30分钟。
（10） 当蓝色的溴酚蓝迁移到距凝胶边缘1cm时，关闭电源。取出模具和凝胶。
（11） 把凝胶放入凝胶成像系统中拍照。
（12） 清理桌面垃圾，清洗实验仪器，撰写实验报告。
7．思考
（1） 泳道中的质粒DNA有几条带？为什么？ （2） 溴酚蓝的迁移率相当于多少bp的DNA? （3） 影响本实验结果的因素有哪些？
实验三 质粒DNA的酶切
1．目的
学会用限制性内切酶切割质粒DNA。
2．原理
II型限制性内切酶能识别双链DNA内部的特殊序列并在识别位点处将双链切断，形成粘性末端或齐平末端，通过电泳酶切后的DNA混合物能够确认和分离酶切片段。
3．器材
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml微量离心管，双面微量离心管架，水漂，恒温水浴。
4．试剂
Pinpoint™xa-3质粒，EcoR V，BamH I，内切酶缓冲液（10×），10×电泳加样缓冲液，荧光染料。
5．实验准备
配制TAE电泳缓冲液（50´储存液），10´加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。
6．操作步骤
（1）混合下列溶液于一个无菌的1.5ml微量离心管中：
Pinpoint™xa-3 DNA (或pUCm-T-CHI ) 6 μl 10×酶切缓冲液（用EcoRV的缓冲液）
2 μl ddH2O 30 μl EcoRV 1μl BamHI 1μl 总体积 40μl
（2）先准备一个冰盒并放入一定量的冰块。从-20℃冰柜中取出限制性内切酶，立即插入冰块中。
（3）用一只手的手指捏在盛放酶的微量离心管的上部（以免手指的给酶液加温），另一只手持微量移液器，小心翼翼地吸取1 μl限制性内切酶。
（4）在酶切样品混合液中加入限制性内切酶后（立即把内切酶原液送回冰柜！），轻轻震动微量离心管使管中的溶液混匀。再在离心机中1000rpm离心10秒。取出后插到水漂的孔中，在推荐的最适酶切温度水浴中温育1~3 h（一般是 37℃）。
（5）酶切后取少量酶切产物与合适的已知分子量的DNA（如先前的PCR产物）对比电泳，以确认切下的片断是否为自己想要的片断。
（6）酶切后的质粒可以回收备用（见实验六：从琼脂糖凝胶中回收DNA片段）。
（7）清理桌面垃圾，清洗实验仪器。撰写实验报告。
7．思考
（1）酶切反应混合物的体积是否对酶切效果有影响？为什么？
（2）如何估计DNA用量和酶的用量？
（3）在吸取内切酶的时候如何操作才能避免浪费？
第二部分 目的基因的获得和重组载体的构建
实验四 PCR扩增制备目的基因
1．目的
学会PCR操作的基本技术。
2．原理
是将待扩增的DNA模板加热变性，与其两侧互补的寡聚核苷酸引物复性，然后经过耐热的DNA聚合酶延伸。再进入下一轮变性—复性—延伸的循环，n次循环后DNA可被扩增（1+X）倍。其中
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，0.2ml PCR微量管，双面微量离心管架，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，水漂，恒温水浴。
4．试剂
n 5U/μl Taq DNA聚合酶，PCR缓冲液（10×，MgCl2 free），25mM MgCl2，dNTP，引物，模板质粒pBS-CHI，无菌ddH2O。
5．实验准备
dNTP混合液（每种25mM），TAE电泳缓冲液，荧光染料，10´加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。
合成的引物：Sense primer 5＇-GGATCCACAATGATGAGAGCC-３＇
Antisense primer ５＇-GATATCATGGTGAGGTAGCTAGCTT-３＇
目的基因模板质粒：已经克隆在pBS载体上的1128bp几丁质酶（chitinase，CHI）基因。
待扩增的CHI片段长度：996bp。
6．操作步骤
（1） 在0.2ml PCR 微量离心管中配制50μl反应体系。（以下加样量供参考，括号内是最终需要量，实验时需参照Taq酶说明书计算）
ddH2O 32μl
10×PCR buffer（不含MgCl2）
5μl
25mM MgCl2 3μl
2.5mmol/L dNTP 4μl（每种dNTP终浓度0.2mM）
10μmol/L Primer1 2μl（12.5~25pmoles）
10μmol/L primer2 2μl（12.5~25pmoles）
模板质粒 1μl（1×10pmoles）
5U/μl Taq酶 1μl（5U）
总体积
50μl
（2）根据厂商的操作手册设置PCR仪的循环程序：
-3 ① 94℃ 5min ② 94℃ 1min ③ 54℃ 1min ④ 72℃ 1min50s ⑤ goto② 29 times ⑥ 72℃ 10min （3）PCR结束后，取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳。观察胶上是否有预计的主要产物带。
（4）清理桌面，撰写实验报告。
（5）PCR产物可以直接与T载体连接（见实验五），然后转化感受态细胞（见实验八）。
7．思考
（1）复性温度如何确定？
（2）为什么要在最后延伸10min？
（3）是否有非特异性扩增产物（或引物二聚体），如何才能消除？
实验五 目的基因片段与载体连接
1．目的
学会DNA片段的体外连接技术。
2．原理
在Mg和ATP存在下，T4 DNA连接酶能催化载体分子的粘性末端与外源DNA的相同粘性末端联接成重组DNA分子。
3．器材
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，台式离心机，干式恒温气浴。
2+4．试剂
pUCm-T 载体，Pinpoint™xa-3酶切载体，CHI插入片断，T4 DNA 连接酶，连接酶缓冲液，无菌ddH2O。
5．实验准备
1.5ml离心管装入饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）；
平板培养基（含Amp）。
6．操作步骤
1）PCR产物与pUCm-T载体直接连接：
（1） 事先将干式恒温仪（或冰盒里的水）温度设定在14～16°C。
（2） 取一个灭菌的0.2ml微量离心管，加入：
4μl PCR 产物混合液 1μl pUCm-T载体
0.5μl T4 DNA连接酶（TAKARA, 350U/ul） 1μl 连接酶缓冲液 3.5μl ddH2O 总量 10μl 体系
（3） 上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于16°C水中保温过夜。
（4） 连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4°C冰箱备用。
2）DNA回收片断（CHI）与载体（Pinpoint™xa-3）连接：
（1） 取一个灭菌的0.2ml微量离心管，加入 4μl 回收DNA片断 1μl 酶切后回收的载体
0.5μl T4 DNA连接酶（TAKARA, 350U/ul） 1μl 连接酶缓冲液 3.5μl ddH2O 总量 10μl 体系
（2） 上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于16°C干式恒温仪（或16°C水中）中保温过夜。
（3） 连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4°C冰箱备用。
7．思考
（1）连接酶的最适温度室多少？
（2）为什么要采用16°C下连接？
（3）如何确定插入片段的用量与质粒载体的用量？
实验六 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段
1．目的
学会从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的基本技术。
2．原理
限制性内切酶切割后的DNA片断经过电泳后，按分子量大小被分开，排列在琼脂糖凝胶中，可以将特定的某条DNA带所在的凝胶切下来，加热或用特殊的试剂熔解凝胶，使DNA溶回到溶液中，再经过乙醇沉淀或过柱即可获得目的DNA酶切片段。
3．器材
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，微波炉，水漂，恒温水浴。
4．试剂
电泳缓冲液，荧光染料，电泳级琼脂糖粉，10´加样缓冲液，DNA分子量标准（DL2000），DNA凝胶回收试剂盒。
5．实验准备
配制TAE电泳缓冲液（10´储存液），10´加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）；
6．操作步骤 （1）用1´TAE配制1%琼脂糖凝胶。DNA用合适的酶切。
（2）在胶上选定两个加样孔，分别加入少量（10μl）和大量（50μl ）DNA酶切产物，电泳。
（3）电泳结束后用刀片切下含有少量DNA酶切产物的泳道（一般选择位于凝胶的边缘），在紫外灯下找到目的DNA带，用刀片切在带的下上下边缘各切一个小口作为标记。注意：含有大量DNA酶切产物的凝胶既不用加荧光染料，也不用紫外灯照射！
（4）将做好标记的凝胶条与未染色的凝胶原位对齐，根据小胶条上的标记估计未染色的大胶上DNA酶切产物的位置，用刀片切下大胶中DNA产物所在的凝胶（尽量不要多余的凝胶），转移至一个称量过的干净的1.5ml微量离心管中。再称量后计算出胶的重量。
（5）按照北京鼎国生物技术有限公司生产的DNA快速纯化/回收试剂盒操作说明，纯化回收目的片段。
纯化/回收试剂盒组成：
溶液A：6M NaClO4，0.03M NaAc，pH5.2，少量酚红；
溶液B：3M NaAc；
溶液C：用时加入35ml无水乙醇；
溶液D：TE缓冲液。
胶回收步骤如下：
① 将切下的胶带放入1.5ml离心管中，按照1：3 (胶带重量：溶液A的体积)的比例加入溶液A；
② 50℃水溶10min，胶带完全要求完全溶化，其间可振荡助溶2～3次，待溶化后置室温加入15μl溶液B，充分混匀；
③ 将溶液置于离心柱中，静置2min，10000rpm离心20s；
④ 倒掉液体，加入500μl溶液C于离心柱中10000rpm离心20s，弃液体，重复该步骤一次；
⑤ 12000rpm离心1min，甩干剩余液体以除去残余乙醇；
⑥ 将离心柱置于新的离心管中，室温敞开离心管盖放置5～10min，使乙醇挥发殆尽；
⑦ 加入20～30μl溶液D(使用前50℃水浴)，静置2min；
⑧ 12000rpm离心1min，管底溶液即为所需DNA，将DNA贮存于-20℃可长期保存。
（6）清理桌面，撰写实验报告。
7．思考
（1）为何避免用荧光染料染色和用紫外灯照射目的DNA？
第三部分 感受态细胞的制备和转化及筛选鉴定
实验七 感受态菌的制备
1．目的
学会CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞。
2．原理
细菌在0℃ CaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的状态。
3．器材
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，50ml 微量离心管，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环。
4．试剂
E.coli XL1-Blue，LB培养基，0.1 mol/L CaCl2溶液，无菌ddH2O 5．实验准备
1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）；
平板培养基，LB培养基（灭菌），冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液（灭菌），无菌ddH2O，摇菌试管（灭菌），三角烧瓶（灭菌）。
6．操作步骤
（1）取一支无菌的摇菌试管，在超净工作台中加入2ml LB（不含抗菌素！）培养基。
（2）从超低温冰柜中取出XL1-Blue菌种，放置在冰上。在超净工作台中用烧红的接种环插入冻结的菌中，然后接入含2ml LB培养基的试管中，37℃摇床培养过夜。
（3）取0.5ml上述菌液转接到含有50ml LB培养基的三角烧瓶中，37℃下250r/min摇床培养2~3h，测定OD600为0.375（
（4）将菌液分装到1.5ml预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置10min，然后于4℃，5000rpm离心10min。
（5）将离心管倒置以倒尽上清液，加入1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中放置30min。
（6）4℃，5000rpm离心10min，弃上清液后，用1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂悬，插入冰中放置30min。
（7）4℃，5000rpm离心10min，弃上清液后，用200μl 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂悬，超净工作台中按每管100ml分装到1.5ml离心管中。可以直接用作转化实验，或立即放入-80℃超低温冰柜中保藏（可存放数月）。
（8）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。
7．思考
（1）制作感受态菌的过程中，应注意那些关键步骤？
（2）CaCl2溶液的作用是什么？
实验八 细菌转化
1．目的
学会质粒DNA转化感受态受体菌的技术。
2．原理
质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA。然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。
3．器材
8旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。
4．试剂
LB培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌ddH2O，IPTG，X-gal。
5．实验准备
无菌ddH2O，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配）。
6．操作步骤
（1） 事先将恒温水浴的温度调到42℃。
（2） 从-70℃ 超低温冰柜中取出一管（100μl）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5~10min。
（3） 加入5μl连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100ng），轻轻震荡后放置冰上20min。
（4） 轻轻摇匀后插入42℃水浴中1~2min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3~5min。
（5） 在超净工作台中向上述各管中分别加入500μl LB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1h。
（6） 在超净工作台中取上述转化混合液100~300μl，分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂）。
（7） 如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，滴完菌液后再在平板上滴加40μl 2% X-gal，8μl 20% IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。
（8） 在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37℃恒温培养箱中30-60min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。
（9） 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。
（10） 观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。
7．思考 （1）影响转化效率的因素有哪些？
（3）白色菌落出现的原理是什么？
实验九 转化克隆的筛选和鉴定
1．目的
学会用酶切法或PCR法筛选重组质粒转化成功的克隆菌。
2．原理
利用转化后宿主菌所获得的抗菌素抗性性状筛选出获得质粒的菌落克隆。再从这些菌落中鉴定出质粒上带有外源基因插入片段的克隆菌落。
3．器材
旋涡混合器，小镊子，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，超净工作台，酒精灯，无菌牙签，摇菌管。
4．试剂
LB培养基（加抗菌素），PCR用试剂，引物，质粒提取用试剂，酶切需要的限制性内且酶及其缓冲液，70%甘油（70%甘油，0.1mol/L MgSO4，0.025mol/L Tris-HCl pH8.0）。
5．实验准备
无菌ddH2O，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）；
牙签（灭菌），摇菌管（灭菌），100mg/ml氨苄青霉素。
6．操作步骤
方法一：酶切鉴定
（1）在超净工作台中取3支无菌摇菌管，各加入3ml LB（含50mg/ml氨苄青霉素），用记号笔写好编号。
（2）在超净工作台中将70%乙醇浸泡的小镊子头用酒精灯烤过，镊取一支无菌牙签。用牙签的尖部接触转化的平板培养基上的一个白色菌落，然后将牙签放入盛有3ml LB（含50mg/ml Amp）的摇菌管中。用此法随机取3个白色菌落，分别装入3个摇菌管中。
（3）37℃摇菌过夜后，用碱裂解法分别提取质粒。摇菌管中的剩余菌液保留在4℃冰箱中。
（4）将提取到的3管质粒样品与空质粒同时电泳，根据分子量判断和选区有插入片段的质粒，然后可用酶切、与目的片段一同电泳来鉴定其上的外源插入片段大小是否与预期相符。
（5）将经过鉴定判断为正确的质粒保存。按照编号找到冰箱中原菌液。根据需要进行放大培养提取其质粒或进行诱导表达，或取500ml菌液与500ml 70%甘油混合后-80℃保存。
（6）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。
方法二：快速PCR筛选法
（1） 在转化的平板培养基上随机选取3个边缘清晰的白色菌落，并用记号笔在其所在的培养皿底部玻璃背面画圈做标记编号。
（2）在0.2ml PCR 微量离心管中配制25μl反应体系。
ddH2O 16μl
10×PCR buffer（不含MgCl2） 2.5μl
25mM MgCl2 1.5μl
2.5mmol/L dNTP 2μl（每种dNTP终浓度0.2mM）
10μmol/L Primer1 1μl（12.5~25pmoles）
10μmol/L primer2 1μl（12.5~25pmoles）
Taq酶 0.5μl（1.5U）
总体积 25μl
模板质粒：
用小tip头轻轻粘一下选中的白色菌落，伸入PCR混合液中洗一洗。
（2）根据厂商的操作手册设置PCR仪的循环程序：
① 94℃ 5min ② 94℃ 1min ③ 54℃ 1min ④ 72℃ 1min50s ⑤ goto② 29 times ⑥ 72℃ 10min （2） PCR结束后，取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳（与原始插入片段同时比对）。观察胶上是否有预计的主要产物带。
（3） 按照编号找到培养皿中的原菌斑，根据需要进行放大培养提取其质粒。
（4） 提取到的质粒与原先的空载体（或已知分子量的质粒）再对比电泳，用酶切以进一步确认。
7．思考
（1）PCR法筛选的优点和缺点是什么？ （2）酶切法与PCR法筛选方案哪个更可靠？
（3）最终确认克隆的方法有哪些？
第四部分 目的基因在原核细胞中表达与SDS-PAGE鉴定
实验十 外源基因的诱导表达
1．目的
了解外源基因在原核细胞中表达的特点和方法。
2．原理
外源基因克隆在含有lac启动子的表达系统中。先让宿主菌生长，lac I产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合抑制下游的外源基因转录。向培养基中加入诱导物IPTG（异丙基硫代-b-D-半乳糖），解除抑制使外源基因大量表达。表达的蛋白可经SDS-PAGE或Western-blotting检测。
3．器材
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，50ml 微量离心管，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环。
4．试剂
LB培养基（加抗菌素），100mg/ml IPTG，20%葡萄糖。
5．实验准备
无菌ddH2O，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌），牙签（灭菌），摇菌管（灭菌），100mg/ml IPTG （过滤灭菌）（100ml分装，-20°C保存），100mg/ml氨苄青霉素（过滤灭菌）（100ml分装，-20°C保存），配制20%葡萄糖（8磅灭菌20分钟，添加至上述LB中，终浓度为0.2%）。
6．操作步骤
（1） 晚上9：00接种。在超净工作台中接种含有Pinpoint™xa-3-CHI重组载体的菌株，培养于两个三角烧瓶各20ml LB-葡萄糖培养基（含抗菌素Amp 120μg/ml）的摇菌管中，慢速70~90转/分钟30°C摇菌过夜。
（2） 至第二天上午8：30 OD600约为0.5，加IPTG至 100μg/ml，150~170转/分钟37°C诱导1.5-3h。同时做不加IPTG诱导和非转化的空菌诱导的对照培养。
（3） 4000rpm离心15min弃掉上清液，收获菌体，用SDS-PAGE电泳分析（表达蛋白分子量为30kDa）。菌体也可放在-20°C以下保存备用。
（4） 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。
7．思考
（1）IPTG的作用原理是什么？
（2）为什么要增加抗菌素的用量？
实验十一 SDS-PAGE检测表达蛋白
1．目的
学习SDS-PAGE的基本操作，学会用SDS-PAGE检测蛋白。
2．原理
蛋白质在加热变性以后与SDS结合，带上负电荷，在电场的作用下，向正极移动，结果按分子量大小排列在胶板上，含量多的蛋白带纹粗。
3．器材 旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，台式冷冻离心机，制冰机，超声波破碎仪，电磁炉，电泳仪，垂直电泳槽及配套的玻璃和密封条、梳子等。
4．试剂
SDS（十二烷基磺酸钠），Acr（丙烯酰胺），Bis（N,N’-亚甲基双丙烯酰胺），Tris（三羟甲基氨基甲烷），甘氨酸，盐酸，Aps（过硫酸氨），TEMED（四甲基乙二胺），蛋白分子量标准（97.4，66.4，44.3，29.0，20.1，14.3 kDa），溴酚蓝，甘油，冰醋酸，乙醇，b-2-巯基乙醇，考马斯亮蓝R250，甲醇，乙醇。
5．实验准备
1.0mol/L Tris HCl，pH8.8（4°C保存）；
0.5mol/L Tris-HCl，pH6.8（4°C保存）；
10%SDS（室温保存）；
30%Acr/Bis（30g Acr+0.8g Bis dd water 定容至100ml，4°C保存）；
10%Aps （-20°C保存）；
2´上样缓冲液（0.5mol/L Tris HCl，pH6.8 2ml，甘油2ml，20%SDS 2ml， 0.1%溴酚蓝 0.5ml，b-2-巯基乙醇 1.0ml，ddH2O 2.5ml，室温存放）；
5´电泳缓冲液（Tris 7.5g ，甘氨酸36g，SDS 2.5g，加ddH2O至500ml，使用时稀释五倍）；
考马斯亮蓝染色液（考马斯亮蓝R250 0.25g + 45ml甲醇+10ml冰醋酸，用ddH2O定容至100ml）；
脱色液（95%乙醇：冰醋酸：水= 4.5：0.5：5，体积比）；
6．操作步骤
（1） 将表达后的菌体与2´上样缓冲液按1：1混匀于微量离心管中。
（2） 用超声波破碎仪脉冲10次，每次10秒。中间间隔时放入冰中降温。注意一定要将超声波探头插入溶液底部，在溶液表面或上部时容易起泡！
（3） 将上述微量离心管插入水漂中，放在电磁炉锅里的沸水中煮3~5min。然后立即插入冰中。（可在-20°C冰柜中保存）。
（4） 按照教师的演示组装电泳玻璃并用细橡胶管密封底部和侧面然后用夹子夹住（不能夹玻璃的上端以免夹断玻璃的突出段！）。插入梳子后在玻璃上距离梳子齿底部1cm的地方做一个标记。
（5） 配制10%分离胶。按顺序和量（注意体积单位！）取下列溶液混在一个50ml的小烧杯中（注意Tris为 pH8.8）：
Acrylamide-bis 3.96 ml 1M Tris PH8.8 4.38 ml ddH2O 3.432 ml 10% SDS 118.8 μl
TEMED 9.9 μl 10%APS 118.8μl
（6） 加完APS后拿起烧杯轻轻转动几下底部将溶液混匀后，立刻缓缓倒入玻璃夹缝中，直到液面与所作的标记齐平。剩下的胶液留在小烧杯中，倾斜放置。然后在上部用1000ml微量移液器轻轻地沿玻璃壁来回移动加满ddH2O（尽可能不破坏下面的胶液）。然后静置30min。直到烧杯中剩余的溶液凝固。倒出蒸馏水，并倒置玻璃尽可能将水倒尽。
（7） 配支持胶。按顺序和量（注意体积单位！）取下列溶液混在一个50ml的小烧杯中（注意Tris为 pH6.8）：
Acrylamide-bis 0.675 ml 0.5M Tris pH6.8 0.563 ml ddH2O 3.165 ml 10% SDS 45 μl TEMED 7.5 μl 10% APS 45μl
（8） 加完APS后拿起烧杯轻轻转动几下底部将溶液混匀后，立刻倒入玻璃夹缝中，液面与玻璃上边缘齐平。然后再慢慢插入梳子，静置约20min。烧杯中剩下的溶液倾斜放置直到溶液凝固。（此状态可以用塑料薄膜包起来放入冰箱过夜）。
（9） 小心拔出梳子以后，用注射器针头（剪平尖部）吸取梳子齿形成的加样槽中的水，并修平加样槽底部的胶面。
（10） 选取几个形态好的加样槽，在一张纸上做好对应的标记，用微量移液器在侧面的一个加样槽中加入20μl 蛋白分子量标准Marker，其它槽中加入10～20μl自己制作的样品。
（11） 加完样品后，再用微量移液器吸取电泳缓冲液小心把加样槽液面都补平。电泳槽上部倒满电泳缓冲液（约250ml,淹没过加样槽的液面！），电泳槽的下部倒入一半电泳缓冲液（约180ml）。
（12） 接好电极，将电流调至10mA，待溴酚蓝移到分离胶后，在将电流调至18mA，电泳约2~3h，期间随时观察电泳槽上部的液体是否有泄漏（泄漏导致液面下降，电流中断）！当溴酚蓝移到玻璃距底部0.5cm时切断电源。
（13） 在一个搪瓷盘里准备适量的考马斯亮蓝染色液。
（14） 倒掉电泳槽中的缓冲液，取下玻璃，小心用铲子从下部将带有缺口的玻璃板撬起（切不可损坏胶！）。用铲子切去上部的支持胶，并把分离胶从玻璃上剥离倒染液搪瓷盘里（切不可损坏胶！）。
（15） 染色2h后，将染液倒回瓶子里以备重复使用。把胶移入脱色液，过夜。
（16） 观察脱色后胶里的蓝色带纹，与对照比较或寻找异常粗的带纹，并比较其分子量（CHI蛋白约30kDa），判断是否是预期的基因产物。
（17） 清理桌面，写实验报告。
7．思考
（1）影响表达的因素都有哪些？
（2）如何确定凝胶上的某条蛋白质带就是所要表达的外源基因产物？ （3）表达产物的形式是包涵体还是可溶性蛋白？
（4）本实验能否判断表达产物一定是CHI蛋白？还需要什么方法？ （5）如何估计表达产物的分子量？
附录1：表达载体Pinponit™xa-3的图谱：
附录2：所用的chitinase（玉米几丁质酶）序列（GenBank：L00973）：
>L00973
gcaacaccag cttctctaaa gatcacaatg atgagagccc tggcgtggtg gccatgctgg cccgccttct tcgctgtgcc cgctcgcgcc gagcagtgcg ggtcgcaggc cggcggcgcg ctgtgcccca actgcctgtg ctgcagccag ttcgggtggt gcggcagctc cgactactgc ggcagcgggt gccagagcca gtgcagcgca gcctgcagca ccccgaaccc gccgagcagc ggcggcgtgg cgtccatcat ccccgagtcg ctcttcaacc agatgctgct gcaccgcaac gacgcggcgt gccccgccaa cggcttctac acctacgcgg gcttcatcgc ggcggccaac gcgttcccgg gcttggcacc acgggtgcgg cccgacgtgc agaagcgcga gctggcggcg ttcctggcgc agacgtccca cgagacgacg ggcgggtggg cgacggcgcg acggccctac gcctggggct actgcttcaa ggaggagcag ggcggcgcgt cggggccgga ctactgcgag cccagcgccc agtggccgtg cgccgcgggg aagaagtact acgggccgcg ggccatccag atctccatca acatcaacat cgggcccgct ggcaggccat cggcgcccgg catcctcgcc aacccggacc tggtggccac ccgaccccac cgtgtcgttc gaagaccgcc gtctggttct gggatgaccc cgcagtcgcc caagccgtcg tgcaccgacg tcatgacggg gcagtggacg ccctccgccg ctgacacggc cgccggcagg ctgccgggct acggcgtcgt caccaacatc tccaacggcg gcctcgagtg cggccatggc gctgacagcc gcgtcgccga ccggatcggc ttctacaaac gatactgtga cttgcttggg gtcagctacg gcgacaactt ggactgcgcc aaccagacgc ctttcaacgg ctagttaata agctagctac ctcaccatgc atgtctgcct tattattaga gacacaataa gacctgatcg atatgatgat gggtatgcat gtattacttt actacacgca gatccagcaa tcaagaataa agcaaattaa tgtttact
附：
DL2000分子量标准（bp） 低分子量蛋白质Marker（kDa）
附录3：本实验所用的pUCm-T克隆载体图谱
选做实验
实验一 拟南芥基因组DNA的分离提取
【实验目的】
F 掌握拟南芥基因组DNA的抽提原理和方法。
【实验原理】
通常采用机械研磨的方法破碎拟南芥的组织和细胞，由于拟南芥细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。
十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)是离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入异戊醇使DNA沉淀，即得拟南芥总DNA。
【实验器材】
F 试剂耗材：提取液（0.2M Tris-HCl(pH7.5)、0.5%SDS、0.25M NaCl、1%β-巯基乙醇）、异丙醇、氯仿、异戊醇、RNAase A、研钵、液氮、1.5ml离心管。
F 仪器：恒温水浴锅、离心机。
【方法步骤】
（1） 取新鲜的拟南芥叶片2~3片加入1.5ml的离心管中，加入液氮，玻璃棒研碎。
（2） 研磨以后，加入600~700µl的提取液，混匀，然后在60℃下水浴20~60分钟。
（3） 4℃，12000rpm/min离心10分钟。
（4） 把上清转至新的离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），4℃，12000rpm/min离心7分钟。
（5） 把上清转至新的离心管中，加入70%体积的异丙醇，混匀，4℃，12000rpm/min离心15分钟。
（6） 弃上清，70%乙醇洗涤沉淀2次，吹干。
（7） 沉淀用20~30µl含有0.1mg/ml RNAase A的ddH2O溶解。
（8） 用0.8%的琼脂糖凝胶检测提取的拟南芥总DNA。
【实验结果】
1.拟南芥总DNA的电泳结果。 【实验思考】
1.依据你的理解，拟南芥总DNA的提取过程中应注意那些操作？ 【参考文献】
邹华文，黄丛林.一种简单快速的拟南芥基因组DNA的微量提取方法.长江大学学报B（自然科学版），2006，4 .
实验二 果蝇白眼突变基因的克隆
【实验目的】
F 掌握T克隆的原理和方法。
F 了解质粒提取的原理和方法。
【实验原理】
外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg、ATP存在的连接缓冲系统中，将载体分子与外源DNA分子进行连接。Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物，其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基，可以与pMD18-T Vector 末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。将携带目的基因的T质粒转入大肠杆菌并对其进行蓝白斑筛选鉴定，挑选出所需的重组质粒。
【实验器材】
F 试剂耗材：Taq DNA聚合酶、安苄青霉素、葡萄糖、X-gal、IPTG、pMD18-T载体、LB培养基、培养皿、涂玻棒、移液枪、枪头、1.5ml离心管、PCR管、溶液I、溶液II、溶液III、苯酚、三氯甲烷、95%乙醇、无水乙醇、RNAase A、DNA Marker。
2+F 仪器：PCR仪、恒温培养箱、恒温摇床、恒温水浴锅、离心机、无菌操作台。
【方法步骤】
（一） 引物设计
从NCBI上下载果蝇的白眼突变基因序列（GenBank登录号：X51749），依照此序列用Primer 5.0软件分别设计上游和下游扩增引物。
（二） 目的基因片段的PCR扩增 25µl反应体系：
模板cDNA 1.5µl 10×reaction buffer 2.5µl 2.5mM MgCl2 2µl 2.5mM dNTP 2µl 上游引物 1µl 下游引物 1µl Taq DNA聚合酶 0.2µl 加ddH2O至总体积 25µl 按照以下程序进行PCR扩增：
94℃预变性4min；
94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸1min，共30个循环；
72℃总延伸10min，4℃保存。
取5µl PCR产物与荧光染料混合均匀在1%琼脂糖凝胶电泳(1×TAE电泳缓冲液、100V恒压)，用凝胶成像系统照相观察，确定所得DNA片段的大小和纯度。
（三）目的基因片段PCR产物的纯化回收
将PCR产物与荧光染料混合均匀进行1%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下用干净刀片切下含目的基因片段的胶带。按照北京鼎国生物技术有限公司生产的DNA快速纯化/回收试剂盒操作说明，纯化回收目的片段。
（四）目的基因片段与克隆载体的连接
PCR产物经试剂盒纯化回收后，通过T/A克隆的方法，直接与pMD18-T载体连接，连接反应体系如下：
纯化回收的PCR产物 4μl Ligation SolutionⅠ 5μl pMD18-T Vector DNA 1μl 混匀后16℃连接过夜。产物可于-20℃保存。
（五）连接产物的转化
(1) 取出-80℃保存的制备好的感受态细胞，冰上放置10～20min融化；
(2) 加入5μl连接产物，轻轻混匀后冰上放置30～40min；
(3) 42℃水浴中热击90s，轻轻放回冰上冷却2min；
(4) 加入880µl LB液体培养基(不含氨苄青霉素)和20µl葡萄糖，37℃摇荡培养1h；
(5) 制备X-gal平板：取40μl X-gal、4µl IPTG和56µl灭菌双蒸水混匀后均匀地涂布于含100µg/μl氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，放置1h以充分吸收；
(6) 取适量的菌液(200µl)，涂布于X-gal平板上，37℃培养1h后，倒置培养14～16h。
（六）重组质粒的筛选
分别挑取白色和蓝色单菌落于5ml LB液体培养基中(含100µg/µl氨苄青霉素)，37℃振荡过夜培养，用碱裂解法抽提质粒DNA。步骤如下：
(1) 取适量菌液于1.5 ml的离心管中，瞬时离心，倒掉培养基，尽可能倒干净；
(2) 加溶液I 100μl，涡旋重新悬浮沉淀；
(3) 加溶液II 200μl，轻轻摇匀，在冰上放置3～5min使大肠杆菌裂解，释放质粒DNA；
(4) 加预冷的溶液III 150μl，轻轻颠倒摇匀，出现白色絮状沉淀，在冰上放置3～5min停止裂解反应；
(5) 4℃，12000rpm离心8min，转移上清至1.5ml离心管；
(6) 以体积比1:1的比例加入400μl平衡酚和三氯甲烷，轻轻摇匀，静置2分钟；
(7) 4℃，12000rpm离心10min，转移上清至1.5ml离心管；
(8) 加入400μl三氯甲烷摇匀， 4℃，12000rpm离心5min；
(9) 取上清加2倍体积预冷的无水乙醇，4℃，12000rpm离心8min；
(10) 弃上清液,加75%乙醇1000μl洗涤2次，放置干燥；
(11) 加50μl 双蒸水(含20μg/ml的 RNase)，37℃保温2h，电泳检测(电泳中以蓝斑质粒DNA为对照，出现滞后带的确认为重组质粒)后-20℃保存备用。
(七) 重组质粒的测序验证
将提取纯化后的质粒送至上海生物工程公司进行测序得到克隆基因的碱基序列，分析验证克隆的目的基因的正确性。
【实验结果】
2.目的基因的PCR电泳结果。 3.质粒电泳结果。
4.测序验证结果。
【实验思考】
1.目的基因片段与克隆载体连接过程中的注意事项。
2.影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项。 3.简述热激法转化和蓝白筛选的原理。
4.简述碱裂解法提取质粒的原理以及各试剂的作用。 【参考文献】
1.J.萨姆布鲁克， D.W 拉塞尔.《分子克隆实验指南》（第三版），科学出版社，2002.2.Pepling M, Mount S M.Sequence of a cDNA from the Drosophila melanogaster white gene.Nucleic Acids Res.1990,18(6):1633.
实验三 家蚕油蚕突变基因的克隆
【实验目的】
F 掌握T克隆的原理和方法。
F 了解质粒提取的原理和方法。
【实验原理】 外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg、ATP存在的连接缓冲系统中，将载体分子与外源DNA分子进行连接。Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物，其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基，可以与pMD18-T Vector 末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。将携带目的基因的T质粒转入大肠杆菌并对其进行蓝白斑筛选鉴定，挑选出所需的重组质粒。
【实验器材】
F 试剂耗材：Taq DNA聚合酶、安苄青霉素、葡萄糖、X-gal、IPTG、pMD18-T载体、LB培养基、培养皿、涂玻棒、移液枪、枪头、1.5ml离心管、PCR管、溶液I、溶液II、溶液III、苯酚、三氯甲烷、95%乙醇、无水乙醇、RNAase A、DNA Marker。
F 仪器：PCR仪、恒温培养箱、恒温摇床、恒温水浴锅、离心机、无菌操作台。
【方法步骤】
（三） 引物设计
从NCBI上下载家蚕油蚕突变基因序列（GenBank登录号：AB060285），依照此序列用Primer 5.0软件分别设计上游和下游扩增引物。
（四） 目的基因片段的PCR扩增 25µl反应体系：
模板cDNA 1.5µl 10×reaction buffer 2.5µl 2.5mM MgCl2 2µl 2.5mM dNTP 2µl 上游引物 1µl 下游引物 1µl Taq DNA聚合酶 0.2µl 加ddH2O至总体积 25µl 按照以下程序进行PCR扩增：
2+ 94℃预变性4min；
94℃变性40s，48℃退火40s，72℃延伸1min，共30个循环；
72℃总延伸10min，4℃保存。
取5µl PCR产物与荧光染料混合均匀在1%琼脂糖凝胶电泳(1×TAE电泳缓冲液、100V恒压)，用凝胶成像系统照相观察，确定所得DNA片段的大小和纯度。
（三）目的基因片段PCR产物的纯化回收
将PCR产物与荧光染料混合均匀进行1%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下用干净刀片切下含目的基因片段的胶带。按照北京鼎国生物技术有限公司生产的DNA快速纯化/回收试剂盒操作说明，纯化回收目的片段。
（四）目的基因片段与克隆载体的连接
PCR产物经试剂盒纯化回收后，通过T/A克隆的方法，直接与pMD18-T载体连接，连接反应体系如下：
纯化回收的PCR产物 4μl Ligation SolutionⅠ 5μl pMD18-T Vector DNA 1μl 混匀后16℃连接过夜。产物可于-20℃保存。
（五）连接产物的转化
(1) 取出-80℃保存的制备好的感受态细胞，冰上放置10～20min融化；
(2) 加入5μl连接产物，轻轻混匀后冰上放置30～40min；
(3) 42℃水浴中热击90s，轻轻放回冰上冷却2min；
(4) 加入880µl LB液体培养基(不含氨苄青霉素)和20µl葡萄糖，37℃摇荡培养1h；
(5) 制备X-gal平板：取40μl X-gal、4µl IPTG和56µl灭菌双蒸水混匀后均匀地涂布于含100µg/μl氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，放置1h以充分吸收；
(6) 取适量的菌液(200µl)，涂布于X-gal平板上，37℃培养1h后，倒置培养14～16h。
（六）重组质粒的筛选 分别挑取白色和蓝色单菌落于5ml LB液体培养基中(含100µg/µl氨苄青霉素)，37℃振荡过夜培养，用碱裂解法抽提质粒DNA。步骤如下：
(1) 取适量菌液于1.5 ml的离心管中，瞬时离心，倒掉培养基，尽可能倒干净；
(2) 加溶液I 100μl，涡旋重新悬浮沉淀；
(3) 加溶液II 200μl，轻轻摇匀，在冰上放置3～5min使大肠杆菌裂解，释放质粒DNA；
(4) 加预冷的溶液III 150μl，轻轻颠倒摇匀，出现白色絮状沉淀，在冰上放置3～5min停止裂解反应；
(5) 4℃，12000rpm离心8min，转移上清至1.5ml离心管；
(6) 以体积比1:1的比例加入400μl平衡酚和三氯甲烷，轻轻摇匀，静置2分钟；
(7) 4℃，12000rpm离心10min，转移上清至1.5ml离心管；
(8) 加入400μl三氯甲烷摇匀， 4℃，12000rpm离心5min；
(9) 取上清加2倍体积预冷的无水乙醇，4℃，12000rpm离心8min；
(10) 弃上清液,加75%乙醇1000μl洗涤2次，放置干燥；
(11) 加50μl 双蒸水(含20μg/ml的 RNase)，37℃保温2h，电泳检测(电泳中以蓝斑质粒DNA为对照，出现滞后带的确认为重组质粒)后-20℃保存备用。
(七) 重组质粒的测序验证
将提取纯化后的质粒送至上海生物工程公司进行测序得到克隆基因的碱基序列，分析验证克隆的目的基因的正确性。
【实验结果】
5.目的基因的PCR电泳结果。 6.质粒电泳结果。
7.测序验证结果。
【实验思考】
5.目的基因片段与克隆载体连接过程中的注意事项。
6.影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项。 7.简述热激法转化和蓝白筛选的原理。
8.简述碱裂解法提取质粒的原理以及各试剂的作用。
【参考文献】
1.J.萨姆布鲁克， D.W 拉塞尔.《分子克隆实验指南》（第三版），科学出版社，2002.2.Kômoto N.deleted portion of one of the two xanthine dehydrogenase genes causes translucent larval skin in the oq mutant of the silkworm (Bombyx mori).Insect Biochem Mol Biol.2002 ,32(6):591-597.
实验四 拟南芥叶片花斑突变基因的克隆
【实验目的】
F 掌握T克隆的原理和方法。
F 了解质粒提取的原理和方法。
【实验原理】
外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg、ATP存在的连接缓冲系统中，将载体分子与外源DNA分子进行连接。Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物，其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基，可以与pMD18-T Vector 末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。将携带目的基因的T质粒转入大肠杆菌并对其进行蓝白斑筛选鉴定，挑选出所需的重组质粒。
【实验器材】
F 试剂耗材：Taq DNA聚合酶、安苄青霉素、葡萄糖、X-gal、IPTG、pMD18-T载体、LB培养基、培养皿、涂玻棒、移液枪、枪头、1.5ml离心管、PCR管、溶液I、溶液II、溶液III、苯酚、三氯甲烷、95%乙醇、无水乙醇、RNAase A、DNA Marker。
F 仪器：PCR仪、恒温培养箱、恒温摇床、恒温水浴锅、离心机、无菌操作台。
【方法步骤】
2+
（五） 引物设计
从NCBI上下载拟南芥叶片花斑突变基因序列（GenBank登录号：NM_123592），依照此序列用Primer 5.0软件分别设计上游和下游扩增引物。
（六） 目的基因片段的PCR扩增 25µl反应体系：
模板cDNA 1.5µl 10×reaction buffer 2.5µl 2.5mM MgCl2 2µl 2.5mM dNTP 2µl 上游引物 1µl 下游引物 1µl Taq DNA聚合酶 0.2µl 加ddH2O至总体积 25µl 按照以下程序进行PCR扩增：
94℃预变性4min；
94℃变性40s，45℃退火40s，72℃延伸1min，共30个循环；
72℃总延伸10min，4℃保存。
取5µl PCR产物与荧光染料混合均匀在1%琼脂糖凝胶电泳(1×TAE电泳缓冲液、100V恒压)，用凝胶成像系统照相观察，确定所得DNA片段的大小和纯度。
（三）目的基因片段PCR产物的纯化回收
将PCR产物与荧光染料混合均匀进行1%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下用干净刀片切下含目的基因片段的胶带。按照北京鼎国生物技术有限公司生产的DNA快速纯化/回收试剂盒操作说明，纯化回收目的片段。
（四）目的基因片段与克隆载体的连接
PCR产物经试剂盒纯化回收后，通过T/A克隆的方法，直接与pMD18-T载体连接，连接反应体系如下：
纯化回收的PCR产物 4μl Ligation SolutionⅠ 5μl pMD18-T Vector DNA 1μl 混匀后16℃连接过夜。产物可于-20℃保存。
（五）连接产物的转化
(1) 取出-80℃保存的制备好的感受态细胞，冰上放置10～20min融化；
(2) 加入5μl连接产物，轻轻混匀后冰上放置30～40min；
(3) 42℃水浴中热击90s，轻轻放回冰上冷却2min；
(4) 加入880µl LB液体培养基(不含氨苄青霉素)和20µl葡萄糖，37℃摇荡培养1h；
(5) 制备X-gal平板：取40μl X-gal、4µl IPTG和56µl灭菌双蒸水混匀后均匀地涂布于含100µg/μl氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，放置1h以充分吸收；
(6) 取适量的菌液(200µl)，涂布于X-gal平板上，37℃培养1h后，倒置培养14～16h。
（六）重组质粒的筛选
分别挑取白色和蓝色单菌落于5ml LB液体培养基中(含100µg/µl氨苄青霉素)，37℃振荡过夜培养，用碱裂解法抽提质粒DNA。步骤如下：
(1) 取适量菌液于1.5 ml的离心管中，瞬时离心，倒掉培养基，尽可能倒干净；
(2) 加溶液I 100μl，涡旋重新悬浮沉淀；
(3) 加溶液II 200μl，轻轻摇匀，在冰上放置3～5min使大肠杆菌裂解，释放质粒DNA；
(4) 加预冷的溶液III 150μl，轻轻颠倒摇匀，出现白色絮状沉淀，在冰上放置3～5min停止裂解反应；
(5) 4℃，12000rpm离心8min，转移上清至1.5ml离心管；
(6) 以体积比1:1的比例加入400μl平衡酚和三氯甲烷，轻轻摇匀，静置2分钟；
(7) 4℃，12000rpm离心10min，转移上清至1.5ml离心管；
(8) 加入400μl三氯甲烷摇匀， 4℃，12000rpm离心5min；
(9) 取上清加2倍体积预冷的无水乙醇，4℃，12000rpm离心8min；
(10) 弃上清液,加75%乙醇1000μl洗涤2次，放置干燥；
(11) 加50μl 双蒸水(含20μg/ml的 RNase)，37℃保温2h，电泳检测(电泳中以蓝斑质粒DNA为对照，出现滞后带的确认为重组质粒)后-20℃保存备用。
(七) 重组质粒的测序验证
将提取纯化后的质粒送至上海生物工程公司进行测序得到克隆基因的碱基序列，分析验证克隆的目的基因的正确性。
【实验结果】
8.目的基因的PCR电泳结果。 9.质粒电泳结果。
10.测序验证结果。
【实验思考】
9.目的基因片段与克隆载体连接过程中的注意事项。
10.影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项。 11.简述热激法转化和蓝白筛选的原理。
12.简述碱裂解法提取质粒的原理以及各试剂的作用。 【参考文献】
1.J.萨姆布鲁克， D.W 拉塞尔.《分子克隆实验指南》（第三版），科学出版社，2002.2.Sakamoto W, Tamura T, Hanba-Tomita Y, et al.The VAR1 locus of Arabidopsis encodes a chloroplastic FtsH and is responsible for leaf variegation in the mutant alleles.Genes Cells.2002,7(8):769-780.
实验五 线虫unc-22突变基因的克隆
【实验目的】
F 掌握T克隆的原理和方法。
F 了解质粒提取的原理和方法。
【实验原理】 外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg、ATP存在的连接缓冲系统中，将载体分子与外源DNA分子进行连接。Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物，其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基，可以与pMD18-T Vector 末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。将携带目的基因的T质粒转入大肠杆菌并对其进行蓝白斑筛选鉴定，挑选出所需的重组质粒。
【实验器材】
F 试剂耗材：Taq DNA聚合酶、安苄青霉素、葡萄糖、X-gal、IPTG、pMD18-T载体、LB培养基、培养皿、涂玻棒、移液枪、枪头、1.5ml离心管、PCR管、溶液I、溶液II、溶液III、苯酚、三氯甲烷、95%乙醇、无水乙醇、RNAase A、DNA Marker。
F 仪器：PCR仪、恒温培养箱、恒温摇床、恒温水浴锅、离心机、无菌操作台。
【方法步骤】
（七） 引物设计
从NCBI上下载线虫unc-22基因序列（GenBank登录号：NM_069873），依照此序列用Primer 5.0软件分别设计上游和下游扩增引物。
（八） 目的基因片段的PCR扩增 25µl反应体系：
模板cDNA 1.5µl 10×reaction buffer 2.5µl 2.5mM MgCl2 2µl 2.5mM dNTP 2µl 上游引物 1µl 下游引物 1µl Taq DNA聚合酶 0.2µl 加ddH2O至总体积 25µl 按照以下程序进行PCR扩增：
2+ 94℃预变性4min；
94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸1min，共30个循环；
72℃总延伸10min，4℃保存。
取5µl PCR产物与荧光染料混合均匀在1%琼脂糖凝胶电泳(1×TAE电泳缓冲液、100V恒压)，用凝胶成像系统照相观察，确定所得DNA片段的大小和纯度。
（三）目的基因片段PCR产物的纯化回收
将PCR产物与荧光染料混合均匀进行1%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下用干净刀片切下含目的基因片段的胶带。按照北京鼎国生物技术有限公司生产的DNA快速纯化/回收试剂盒操作说明，纯化回收目的片段。
（四）目的基因片段与克隆载体的连接
PCR产物经试剂盒纯化回收后，通过T/A克隆的方法，直接与pMD18-T载体连接，连接反应体系如下：
纯化回收的PCR产物 4μl Ligation SolutionⅠ 5μl pMD18-T Vector DNA 1μl 混匀后16℃连接过夜。产物可于-20℃保存。
（五）连接产物的转化
(1) 取出-80℃保存的制备好的感受态细胞，冰上放置10～20min融化；
(2) 加入5μl连接产物，轻轻混匀后冰上放置30～40min；
(3) 42℃水浴中热击90s，轻轻放回冰上冷却2min；
(4) 加入880µl LB液体培养基(不含氨苄青霉素)和20µl葡萄糖，37℃摇荡培养1h；
(5) 制备X-gal平板：取40μl X-gal、4µl IPTG和56µl灭菌双蒸水混匀后均匀地涂布于含100µg/μl氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，放置1h以充分吸收；
(6) 取适量的菌液(200µl)，涂布于X-gal平板上，37℃培养1h后，倒置培养14～16h。
（六）重组质粒的筛选 分别挑取白色和蓝色单菌落于5ml LB液体培养基中(含100µg/µl氨苄青霉素)，37℃振荡过夜培养，用碱裂解法抽提质粒DNA。步骤如下：
(1) 取适量菌液于1.5 ml的离心管中，瞬时离心，倒掉培养基，尽可能倒干净；
(2) 加溶液I 100μl，涡旋重新悬浮沉淀；
(3) 加溶液II 200μl，轻轻摇匀，在冰上放置3～5min使大肠杆菌裂解，释放质粒DNA；
(4) 加预冷的溶液III 150μl，轻轻颠倒摇匀，出现白色絮状沉淀，在冰上放置3～5min停止裂解反应；
(5) 4℃，12000rpm离心8min，转移上清至1.5ml离心管；
(6) 以体积比1:1的比例加入400μl平衡酚和三氯甲烷，轻轻摇匀，静置2分钟；
(7) 4℃，12000rpm离心10min，转移上清至1.5ml离心管；
(8) 加入400μl三氯甲烷摇匀， 4℃，12000rpm离心5min；
(9) 取上清加2倍体积预冷的无水乙醇，4℃，12000rpm离心8min；
(10) 弃上清液,加75%乙醇1000μl洗涤2次，放置干燥；
(11) 加50μl 双蒸水(含20μg/ml的 RNase)，37℃保温2h，电泳检测(电泳中以蓝斑质粒DNA为对照，出现滞后带的确认为重组质粒)后-20℃保存备用。
(七) 重组质粒的测序验证
将提取纯化后的质粒送至上海生物工程公司进行测序得到克隆基因的碱基序列，分析验证克隆的目的基因的正确性。
【实验结果】
11.目的基因的PCR电泳结果。 12.质粒电泳结果。
13.测序验证结果。
【实验思考】
13.目的基因片段与克隆载体连接过程中的注意事项。
14.影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项。 15.简述热激法转化和蓝白筛选的原理。
16.简述碱裂解法提取质粒的原理以及各试剂的作用。
【参考文献】
1.J.萨姆布鲁克， D.W 拉塞尔.《分子克隆实验指南》（第三版），科学出版社，2002.2.Wang,W.and Shakes,D.C.Isolation and sequence analysis of a Caenorhabditis elegans cDNA which encodes a 14-3-3 homologue.Gene.1994, 147 (2), 215-218.
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